Eficiência da atividade enzimática e efeito da

temperatura em ScARP1.

A proteína purificada (ScARP1) foi exposta a um substrato de DNA contendo um sítio abásico artificial que apresenta em sua constituição o tetrahydrofuran (THF) (figura 22a). Considerando que o sítio abásico natural é instável e normalmente gera quebras de dupla fita no DNA, não seria o substrato ideal a ser escolhido para os ensaios, logo, foi preferível a escolha de um sítio abásico artificial e mais estável o que permitiria ser reconhecido pela a enzima e, desse modo, comprovar a atividade endonuclease da mesma (SCHERMERHORN & DELANEY, 2013). Caso a proteína ScARP1 apresente atividade AP endonuclease, esta seria capaz de clivar o substrato contendo a lesão e assim formar um produto a ser visualizado no gel de acrilamida com 28 nucleotídeos de tamanho. Este fragmento teria também uma hidroxila livre em sua extremidade 3´como apresentado no esquema da figura 56a. Em vista disso, com o intuito de verificar se a proteína ScARP1 possuía atividade AP endonuclease foram utilizadas diferentes concentrações em nM (nanomolar) desta proteína em presença do já referido substrato. Como observado na figura 22b, em comparação ao controle positivo – a enzima AP endonuclease humana (hAPE) (comercial na concentração de 0,1 U) – a proteína ScARP1 apresentou a função de AP endonuclease, clivando o substrato resultando assim no acúmulo de um produto com 28 nucleotídeos (figura 22b). Na figura 22c foi apresentado um gráfico com a quantificação das bandas do gel de acrilamida observadas.

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Com isso, pode-se evidenciar que na máxima concentração testada (40 nM) de ScARP1 a porcentagem de atividade AP endonuclease foi, aproximadamente, de 30 %.

Sabe-se que outro fator que poderia influenciar a conformação proteica, bem como, a atividade enzimática seria a temperatura. Logo, com o intuito de avaliar qual seria a temperatura ótima para a proteína ScARP1 foi realizado o próximo experimento. O ensaio cujo resultado foi apresentado na figura 22d mostrou como a AP endonuclease de cana-de-açúcar reagiu quando exposta a diferentes temperaturas (20 a 37 °C). Nesta figura pode-se verificar que a temperatura de 37 °C seria aonde a enzima ScARP1 exibiu maior atividade enzimática. Estes dados podem ser observados também na forma de representação gráfica como mostrado na figura 22e.

126 Figura 22– Resultados da eficiência da atividade enzimática de ScARP1 em relação a variação de concentração e temperatura. (a) representação esquemática do substrato utilizado nos ensaios de atividade endonuclease, trata-se de um DNA duplex em que apresenta tetrahydrofuran (THF) que simula um sítio abásico. Quando este e clivado pela a enzima AP endonuclease dá origem a um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). (b) Gel de acrilamida do ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações diferentes da enzima (2, 5, 10, 20 e 40 nM), ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo foi a AP endonuclease I humana (na concentração de 0,1 U). O marcador M1 é o substrato com o tamanho de 58 nucleotideos, DNA de fita dupla, já o marcador M2 trata-se de um DNA simples fita contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (c) Média da atividade enzimática de ScARP1 com diferentes concentrações da mesma (2, 5, 10, 20 e 40 nM). (d) Gel de acrilamida (19:1, 12 % com 7M de Ureia) de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes temperaturas (°C) por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 na concentração de 0,1 U. O marcador (M) trata-se de uma fita simples de DNA contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. (e) Gráfico com as médias da atividade enzimática de ScARP1 em relação a temperatura avaliada. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.

127 4.6.2. Efeito dos íons e concentração de NaCl na atividade de

ScARP1.

Tendo como base que íons podem servir como cofatores enzimáticos atuando no sítio ativo e assim permitindo que uma proteína tenha uma boa atividade, nesta etapa do trabalho foi avaliada quais íons que se associam a proteína ScARP1 e quais deles seriam de grande importância para a sua atividade enzimática. Para isto foi avaliado os íons bivalentes MgCl2, MnCl2 e o CoCl2. Esta escolha de íons teve como base o fato da proteína AtARP de A. thaliana possuir atividade na presença do íon MgCl2. O resultado do ensaio demonstrou que a preferência da proteína em estudo (ScARP1) foi por MgCl2 e MnCl2, sendo este último o que apresentou maior atividade enzimática, principalmente na concentração de 2 mM (figura 23a). Essas observações podem ser confirmadas ao analisar as bandas exibidas neste gel que foram quantificadas e expressas em gráfico como apresentadas na figura 23b. Este gráfico confirma que a porcentagem de maior atividade da enzima ScARP1 foi em MnCl2, quando esse íon bivalente está entre 1 a 2 mM de concentração, decaindo nas concentrações de 5 a 10 mM. Contudo, mesmo assim, os resultados pertinentes ao MnCl2 foram melhores se comparados com os resultados obtidos para o íon MgCl2.

128 Figura 23 - Resultado do efeito dos distintos íons e da concentração de NaCl sob a atividade de ScARP1. (a) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2) ocorrendo a 37 °C por 1 hora. O controle positivo (linha 1) foi a hAPE1 (0,1 U), o gel apresenta dois controles: C1 – Tampão CB (20 mM Tris HCl pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM BtMe, 1 mM EDTA e 50 % glicerol) + substrato +íons, C2 – substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (b) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes íons (MgCl2, MnCl2, CoCl2), o gráfico apresenta dois controles: C1 – Tampão + substrato +íons, C2 – Tampão + substrato + enzima (ScARP1) sem a presença de íons. (c) Gel de acrilamida de ensaio envolvendo a atividade da enzima ScARP1 com concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250) ocorrendo a 37°C por 1 hora. O controle positivo foi a hAPE1 (0,1 U) (linha 8). ), o gráfico apresenta um controles: C1 – Tampão + substrato +íons.(d) Média da atividade enzimática de ScARP1 em relação a diferentes concentrações de NaCl em mM (25, 50, 100, 150, 200, 250).O marcador (M), para todos os géis, trata-se de um DNA fita simples contendo 28 nucleotídeos, com a extremidade com uma hidroxila livre (-OH). Gel revelado a 473 nm, 750V, canal LPB. Os cálculos foram feitos com base em quantificação no programa Multi Gauge v3.0.

A concentração de sal pode também influenciar na estrutura e solubilidade da proteína em condição aquosa. Portanto, foi então avaliado como a

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concentração de sal (NaCl) pode interferir na atividade enzimática da proteína