EIF4Gs

Usando a proteína humana eIF4GI como parâmetro de busca e com o auxílio da ferramenta BLAST foram encontradas cinco proteínas contendo o domínio central do eIF4G em bancos de dados do genoma de L. major, que foram denominadas

LmEIF4G1 a 5. As cinco proteínas variam significativamente em tamanho (1016, 1425,

635, 765 e 782 aa), carga geral (positiva no LmEIF4G1 e negativo nas demais) e na localização do domínio conservado HEAT-1/MIF4G. Ambos os genes LmEIF4G1 e

LmEIF4G2 são localizados no cromossomo 15, enquanto os genes LmEIF4G3, LmEIF4G4 e LmEIF4G5 estão localizados nos cromossomos 16, 36 e 10,

respectivamente. Nenhum domínio óbvio para ligação ao eIF3, ao eIF4E ou à PABP foi identificado baseado apenas na homologia das sequências, entretanto todas as sequências apresentam o domínio HEAT-1/MIF4G. As sequências não compartilham outras semelhanças, com exceção dos LmEIF4G3 e 4. Estas duas proteínas mostram uma região N-terminal curta e uma região conservada de aproximadamente 120 aminoácidos localizada cerca de 180 aminoácidos após o domínio MIF4G, com similaridade aos dois outros domínios HEAT do eIF4GI humano (HEAT-2/MA3 e ou HEAT-3/W2) (Figura 7) (DHALIA et al., 2005).

Figura 7. Esquema dos homólogos do eIF4G de Trypanosoma brucei e seus principais domínios. A

região mais conservada das proteínas, semelhante a outros organismos, é o domínio MIF4G (listras vermelhas). Os homólogos TbEIF4G3 e TbEIF4G4 aparentemente são funcionalmente relacionados, uma vez que, além do domínio HEAT-1/MIF4G, ambos possuem uma região N-terminal curta e uma região conservada de 120 aminoácidos na região C-terminal (listras azuis) que poderia ser um segundo domínio presente em eucariotos, o HEAT-2/MA3 ou o HEAT-3/W2 (ou ambos).

Em um ensaio preliminar, uma proteína recombinante truncada contendo apenas o domínio HEAT-1/MIF4G do LmEIF4G3 foi capaz de se ligar especificamente à proteína LmEIF4AI in vitro (DHALIA et al., 2005). Recentemente, foi mostrado que a incubação de extratos celulares de L. major com a resina m7GTP-Sefarose permitiu a purificação das proteínas LmEIF4E1 e LmEIF4E4, assim como a coeluição das proteínas LmEIF4G3 e LmEIF4AI. Estas interações foram confirmadas a partir da imunoprecipitação da proteína LmEIF4G3 em fusão com FLAG, expressa em células transgênicas de L. major. As proteínas LmEIF4G3, LmEIF4E1 e LmEIF4E4 foram encontradas ainda em frações polissomais indicando a formação de pelo menos um complexo eIF4F nos tripanossomatídeos (YOFFE et al., 2009).

Através de ensaios de pull down in vitro, dos cinco homólogos do eIF4G em L.

major, apenas o LmEIF4G5 não se ligou à proteína LmEIF4AI, entretanto apenas as

proteínas LmEIF4G3 e 4 foram capazes de se ligar aos homólogos do EIF4E de

Leishmania, mostrando que, a princípio, formam-se pelo menos dois complexos eIF4F

nestes parasitas (REIS, 2009). O mesmo trabalho mostrou que a proteína LmEIF4G3 interage forte e especificamente, com as proteínas LmEIF4AI, LmEIF4E4 e LmPABP1,

todas interações esperadas para a proteína eIF4G - arcabouço do complexo eIF4F. Embora a proteína LmEIF4G4 apresente uma ligação mais reduzida ao LmEIF4AI e a

LmPABP1, sua interação com o LmEIF4E3 foi considerada forte e específica.

Na tentativa de identificar os resíduos de aminoácidos responsáveis por essas interações foi descrito recentemente, por meio de ensaios de duplo híbrido, que o

LmEIF4G3 liga-se ao LmEIF4E4 através de sua região N-terminal e que um motivo

formado pelos aminoácidos YPGFSLD seria responsável por essa interação, visto que a mudança do Y, F, ou L por A, individualmente, aboliram a interação com o LmEIF4E4 (YOFFE et al., 2009). Ensaios de pull down in vitro confirmaram o envolvimento de alguns destes resíduos na interação do LmEIF4G3 com o LmEIF4E4. De forma intrigante, apesar da região FSL ser conservada nos homólogos EIF4G3 e EIF4G4 dos Tritryps, mutações pontuais nesta sequência foram capazes de abolir a interação entre

LmEIF4G3/LmEIF4E4, porém não afetou a interação LmEIF4G4/LmEIF4E3.

Entretanto, uma análise detalhada da sequência dos ortólogos do EIF4G4 indicou um novo motivo M/F/YXXXXI/LL, onde os resíduos IL quando modificados são capazes de abolir a interação LmEIF4G4/LmEIF4E3 (Figura 8) (MOURA, 2007; REIS, 2009).

Figura 8. Alinhamento múltiplo comparando as sequências dos homólogos TbEIF4G3 e TbEIF4G4 de

Trypanosoma brucei, com seus ortólogos de Trypanosoma cruzi e Leishmania major. Presença dos motivos IL e FSLXXXX na porção N-terminal (setas simples), sugerido como possível sítio de ligação à subunidade eIF4E. A região de conservação indicada pelos asteriscos é referente ao domínio HEAT1-MIF4G. O outro possível domínio HEAT2-MA3 está destacado na caixa em preto, caracterizando outra região com alguns resíduos conservados. Destaque também para os resíduos de triptófano encontrados na região C- terminal, como possíveis constituintes de um domínio HEAT3-W2 (setas duplas). Os resíduos conservados estão destacados em preto e os com conservação moderada em cinza. Modificado a partir de Moura (2007).

O estudo dos ortólogos de três destas proteínas de T. brucei (TbEIF4G3 a 5) permitiu o uso preliminar de abordagens in vivo para caracterização das mesmas. Através da técnica de interferência de RNA, foi possível observar que as três proteínas são essenciais à viabilidade do parasita, mas os perfis de crescimento das culturas

  *******

TbEIF4G3 1 --- ---MH VYTIDQILEL RSLYPEP-PY PGFSLEEACR RKKQTQT--- ---KLVRGPN AWAARG-SAK TTAEWVERLV YGSLNKLSAA TcEIF4G3 1 --- ---MH VYSIQQILEV RSMYKDA-PY PGFSLEEACR RKKMTQT--- ---KLVRGAN AWVARG-SAK TTEEWVERLV QGSLNKLSTA LmEIF4G3 1 --- ---M QFTVEQIRSV RNNYLEP-PY PGFSLDEVVR RRRLTQT--- ---KLVRGEN AWVAKG-TAQ TTEEWVQRLL HGTLNKLTEE TbEIF4G4 1 MLFKPRGVTS NDPRYAGGSR LMSVSDLLAY RDTWRGRPPT ESFSLAQILR DARAADCKPV VTEKLVMSEN GFKVKSRDSI DSLERGVRAV QSALNKLTEW TcEIF4G4 1 MLFKPRGVTS NDPKYAGNSR IMTIPDLLAY RDTWKER-LS DDFSLGRILF AARAAKSKPA APEKLVMTSN GFKVKDRDAI APSERGVRMV QSTLNKLTES LmEIF4G4 1 MLFNLRGIVP QKEEKVKN-- QMTLADILAF RDTWTAI-PE PNFSLERVLL TARLEKQRKA EIPKLVTSEN GFRVRDKKDM DASELELRRV QGSLNKLTDK ************************************************************************************************************* TbEIF4G3 75 NFNEIVSQLQ TNTIFSSDEM LKKTVSIIFN KALGEPENSN VYAGLCYKLA EYEVSLNVVQ KQ--- --- KEGKRLSKLR NAVVGIAQTE TcEIF4G3 75 NFDDMVAKLQ TEVIFSTKET LNIAVRIIFK KALDEPECSK SYAGVCYKLA EFEVGITAAK QK--- --- AEGKKYSKLR NAVVSIAQEE LmEIF4G3 74 NKDIMIDKLL TKELFATEDI MNMVVNIIFK KALDEPENSK LYAGVCHSLA LYEAKVLRDG HK--- --- GE-RPQSQLR DAIISTAQHE TbEIF4G4 101 NFDVVVQTVL TPDIIINNEV VKDVVRLIYE KALMEPVFAG LYARMCFSIV RFEYEYRTKF LP--- --- GTCQVPSAVR VAIVEKCQQM TcEIF4G4 100 NFDLIAKAIL VPEIILNANV VADVVRLIYD KALVEPVFAG LYARLCYMIV RYEYDYRSTQ SG--- --- EVDAQKSEVR VAIVEKCQQM LmEIF4G4 98 NFDAVVEEAL SPDLVLNPLV LKGAVDIIFN KAMAEPVFSG IYAQLCQRIK VYEQDLVAEA AENPTSELGQ LMAAVQAGDE DQKNVNGRVR NALVKRCQEF ************************************************************************************************************* TbEIF4G3 157 FQNR-RNVPS SEGLSEEEVE QQRSSFMRRK VANMRFIGEL FLHKVLSHST MMDIINIIMQ P----EKGGY PASEDLEFLT VLFTIVGKSL DSIA--- TcEIF4G3 157 FLSR-RKMPS MEGLTEEEME LRRTTFMRRK RANMKFIGEL FMHKVLSCNT MMNIIQTIMQ EA---ERGGY PTSEDIEFLT ELFLTIGESL DAVP--- LmEIF4G3 155 FRTLSKELSK MEDKSEEELE YERSNVMRRK RSNMRFIGEL YLCTALTHST MFTVMDLTMR CS---DKTGF PSSENIELLA ALLNTIGDRL DKN--- TbEIF4G4 183 FTNAVEESK- -QTMSEEQAE RLR----KRN VNNIKFAGEL FLKTLITQKI IDRILNERIY E---MV PNDMELEVII NLLEVVGKLY EEKN--- TcEIF4G4 182 FDGATKAVR- -ETASEEEAE KVR----KRN VNNIKFAGEL FLKSLITQKI IDRILGEKLF N---IT PNDMDLEVVV NLLEVVGKMY EEKH--- LmEIF4G4 198 HDSFVKQP-- -PPRNAEAEE QLR----KRN MANIKFVGEL YMRSLISHRV ILAVCSTALV LGFIPSPKLV TTDADLEMMV SLMNVIGKRF DENAGMALNH ******************************************************

TbEIF4G3 245 ---ELRP KLDAYFKVLE GLK-DQK-IY PPRICFKMLD LIELRRDRNW ESR--- --- --- --- ---ET TcEIF4G3 246 ---ELRV RLNGYFELLE KLK-DQKEVY PPRIRFKMLD LIELRSKFNW ERR--- --- --- --- ---AT LmEIF4G3 244 ---HKK TLDPYFTSLE NFNKKSDCPY PPRIRFKIMD LLDLR-KRGW GLKPKPV--- --- --- --- ---KA

TbEIF4G4 263 ---PD AQEQLWKMLS SMQ--ENRRY SMRIRFLLQN LIDRR-NGGW KPREPEQVVI EDIQSQQQPQ QQSQQQQQQQ --- ---QQ TcEIF4G4 262 ---PA AQPALWKLLG ELQ--EERRF SNRIRFLLQN LIERR-NGGW KPREPEQVIV EDPQ--- ----QQQQQQ --- ---QQ LmEIF4G4 291 VPKDAAAAAH PHDTIWRALN SSM--NDPRF SRRIRFLIQN LLEWR-NDGW KPKESPAQGS SGGSADDSNN TTNNDRSNHR SSNNACNHSN TGGFSGPNEQ

TbEIF4G3 293 VMPKTSAATQ K----EPPRA SDRAVRSSTT P--- --- --NSSNASSS GSKKGKGAGP CDSALG---- -QRAAASTVG KDAREGLKSR TcEIF4G3 295 AAPKTSSQTQ R----EPTRV TDKVVATRS- --- --- ---SMNASSS GSKKGRQDSV SDPAS--- -QQAAAAAAA KTAMGEAGGR LmEIF4G3 296 ALPPSHGKDK KYATAPPPKK GGRDQGSAAA A--- --- --SKSWRDAA TTKTGTAAAP APSADKGLNG RGTSSAAPAA NTAALSSSSA TbEIF4G4 335 QQSQQQPQQQ QQQGQKHYSQ QQRHQQSFPH HNQPQSHGGY HQHPPPPPPP PRNSEYQHTP GMKRGGSYHE VSSSLGMGGR CSQSTNDLTR GGSYNNMPPP TcEIF4G4 324 QQQQQQHQQQ RYHFHHHHHQ QQQHQQHHQQ HHQQQ--- --- QRNSDQLQTP IGKRAKSYQD VSNPYGVGAR RSTSHLDLPG YGAYAMPPPP LmEIF4G4 388 MHRNTAPNNF GSGGSWQQQM QQQHSGGRGP IIGSSNAGGN RGGTRPPSMA DRGDEKYGRG GGPGGLRQGP VSSFNDLSQF PASNDHMMPP PPPFAAPPPP

TbEIF4G3 362 --- ---AWRD VVKSEIVACD DHEMTVTESV AFEERVRSLF QEWLSGYRTG CLPNWQEEFR DCGARPIPDM DLPTAVAAQV VREACMTTRK

TcEIF4G3 360 --- ---SWSN VVKSPQSPRD ATVARAVETV NFEARVRSLF QEWVAECSND FIPEWMNEFR HCQRHFDSED ALCKAAAEVV VREACMTTKK

LmEIF4G3 374 --- ---STAA ATAPAGASFR DEASPQVPLV KFELRVASMF QEWVADRTND VILHWVDQFN TCDRFFESES ELCVAVAQEV IHSACTTTRK

TbEIF4G4 434 --- ----AHGFSD SRLAPEERKR LNFARPPAQL LEEFKKNILF IVRDAAEEGM ADPEGMKVQL N-ALVPQDSN APISEVSVYV TLIRALMDAN

TcEIF4G4 409 PP---P PPTLQYAGVE EQLSVDERKL IVLARPPETL TEEVRRNIFR IARDAVEDGL PNRDWITNDL SRVLGPNESS SQSLMTSVYV ILLRALMDPK

LmEIF4G4 488 FPGEGIMPPS MAPQAASAPG PQMSDEDRKL MALSTPPKCV DADLSSRILS CIRDAHTDGD WAAAGKAIVE A---VPQDAA HMCRMCAVFV IAKKVTETSS

 TbEIF4G3 447 DAQCEASRLM VIGLFLEDDQ VFNGFAAALS SAIEEGILED VPKFSERFAN MLRFTSGD-- -DVKTDVYYD AVRVLCTAYG MLRDPDEMSL STLMEFWGKI TcEIF4G3 445 EAQREASSFL IVGLFLEDDE VLDGFAMALV SAIEEGILED VPKFSERFIN MLRITSGE-- -NTVADVYYD TARVLCTAYG LMREPDEMVL DTMMEFWEKI LmEIF4G3 459 DAQREAFSFL VVGLYMIDTE VFDGFASALA SAIEDGLLED VPKFGERFMS MLRLTSTEQ- -ETRADVYFD AANVLRLTYN RLESPDDSAV DTLMSFWDRV TbEIF4G4 520 ESERKLLLSV LQKGSFENHI LTRGFSWALA KIISDRDCDD CPRIYARFAE AVWSIPSFNF RCVTKDIVSR TAIHLGALSV EYE-SEGEWE EDFIAVWENI TcEIF4G4 502 ESERTLFCTA LESGNWERSI LGRGFAWCLT KIIAERDVAD CPRIYSRFVD VVTRVTELNF LCVTKDIIAR TARYLDVLQV VYD-ETEEWE EDFIHVWDKL LmEIF4G4 585 EADRELFMNS LNSGMFDIKE LTRGYSWCLT SAVAYNVKED FPKVYSRFVA CVTATKSMDF LSMVSNVMAR TANYLDALYV PLEGAQMEWE EDFLEVWTSV 

TbEIF4G3 544 PPP-EKKED- -AIFSLPVVQ SLVTMTKL-- GRAQITGHII SSLHANGLVD DATLHEWLGT PGGE-VDAEV KDAFRKATVG KGTLT TcEIF4G3 542 PRP-ATDEN- -AVLPLQVVQ SLVEMSTR-- GQAPLTGRII ASLHSIGLVH DETVREWLAT PHEE-TSAEV VEAFKKANK- --- LmEIF4G3 557 PLP-STDEEN MIRMDLDVVY SLCNPEGVQD GLEKLLSRII HSMLQMQLMD AEVLDEFLCL DVEDGLCAKV IADYKERFPK --- TbEIF4G4 619 VTASETGRQG ESKPSVADMM ESIAPSCTVP FMCNVLPDFV AVMVQARFFT EEELGAWRNK NKDNSKVFSL LEELSVIYA- --- TcEIF4G4 601 LVA----RQA PNKVTAAESM ESMSFTRLGS FLRGILPDFV ASMVQAGFFT EDELRQWRQE NESNPKFRAI TEELAQLYP- --- LmEIF4G4 685 LGKWREAHPG D-KSTGSDIL NCIASIKQRP FMKDIVSDFM MELSQQGYLD DAETKTWIRE NRTNEKYKVF VDQMEQMYPD TA---

após indução do RNAi mostraram-se diferenciados, onde a depleção do TbEIF4G3 resultou num fenótipo mais pronunciado, com morte das células logo após 24 horas. A análise da superexpressão destes homólogos em fusão à proteína fluorescente amarela (eYFP) mostrou que todas possuiam localização citoplasmática, compatível com um possível papel na tradução (MOURA, 2007). Os dados obtidos em L. major e em T. brucei até o momento indicam EIF4G3 e EIF4G4 como os homólogos funcionais envolvidos na etapa de iniciação da tradução dos tripanossomatídeos.

2.6 Trypanosoma brucei como modelo experimental para estudos de genética