5.2.3. Sistemas de Injeção em Fluxo Associados aos Reatores Tubulares com Detecção Amperométrica
Para a determinação amperométrica H2O2 nas amostras de mel foi utilizado um
sistema FIA semelhante ao descrito no item 4.2.4.. A representação esquemática do digrama de fluxo está ilustrada na figura 50 com a detecção amperomética diferencial feita com auxílio de um potenciostato. De maneira distinta à determinação espectrofotométrica, os registros amperométricos foram obtidos de modo on-line.
Figura 50: Diagrama esquemático do sistema FIA empregado para determinação de peróxido de hidrogênio. A: amostra, B: bomba de aquário, E: eletrólito (solução tampão fosfato pH 7,4), V: válvula de controle do fluxo, L: loop ou alça de amostragem, POD: enzima peroxidase imobilizada em reator tubular, C: célula eletroanalítica, Pstat: potenciostato/galvanostato, M: microcomputador e D: descarte. Na primeira etapa (1) da determinação amperométrica diferencial a amostra ou padrão são injetados sem passar pelo reator tubular. Já na segunda etapa (2) a amostra passa pela peroxidase imobilizada.
D
0 1 2 3 4 5 -1. 0x 10-10 0.0 1.0x10-10 2.0x10-10 3.0x10-10 4.0x10-10 5.0x10-10 6.0x10-10 7.0x10-10 C O R R E NT E (A) TEMPO (min)D
A
L
E
C
M
PEROXIDASE
POD
B
VPstat
(2) (1)D
0 1 2 3 4 5 -1. 0x 10-10 0.0 1.0x10-10 2.0x10-10 3.0x10-10 4.0x10-10 5.0x10-10 6.0x10-10 7.0x10-10 C O R R E NT E (A) TEMPO (min)D
A
L
E
C
M
PEROXIDASE
POD
B
VPstat
(2) (1)5.2.4. Metodologia Analítica
As técnicas eletroanalíticas englobam um grupo de métodos qualitativos e quantitativos e são baseadas no sinal elétrico gerado pela presença de um analito em solução. Têm sido de grande importância no controle dos processos industriais, análise ambiental e em diferentes aplicações na medicina e biotecnologia. Potencial, corrente, concentração e tempo são as principais variáveis monitoradas nessas metodologias com vantagens significativas tais como seletividade, rapidez de resposta, alta sensibilidade e baixo custo. Dentre estas, destaca-se a amperometria, uma técnica voltamétrica em que a informação sobre o analito é obtida através da medida da corrente em função de um potencial fixo, isto é, para um único ponto na curva corrente- potencial. A célula eletroquímica é constituida de três eletrodos imersos em solução contendo o analito e também um excesso de eletrólito não reativo chamado de eletrólito suporte. O potencial elétrico é controlado pelos eletrodos de trabalho e referência, enquanto a corrente é monitorada pelos eletrodos de trabalho e auxiliar, também chamado de contra-eletrodo. [150, 164, 165]
Um sensor químico pode ser considerado um transdutor que responde a um analito através de uma reação química. Seu uso faz necessário para o monitoramento de espécies químicas em tempo real, levado por crescentes necessidades em áreas do meio ambiente e saúde. Baixos limites de detecção, melhoria na precisão e exatidão são preceitos fundamentais e os sensores voltamétricos e amperométricos que monitoram as propriedades elétricas de um analito em solução detém destas características essenciais. Estes sensores são classificados como dinâmicos, pois levam em consideração o fenômeno da interface entre eletrodo e solução, na presença de corrente ou potencial controlado [150]. Como conseqüência imediata, uma vez compreendendo as reações e os processos nos eletrodos pode-se usar este conhecimento para esquematizar reações de modo a aumentar os fenômenos desejáveis e inibir os indesejáveis, com a mudança do material ou a construção de novos eletrodos e medir a concentração das espécies eletroativas, fazendo uso da seletividade do potencial e do material do eletrodo quando em equilíbrio. [164, 165]
Entretanto, um dos grandes problemas encontrados por diversos pesquisadores está no fato de que mais de uma espécie eletroativa pode responder a certas condições estabelecidas. Assim o uso de microeletrodos, eletrodos modificados e biossensores vêm completar as vantagens dos métodos eletroanalíticos constituindo-se uma ferramenta poderosa para a resolução rápida e confiável de análises de amostras complexas. [150]
Um eletrodo modificado tem sua superfície propositalmente alterada por uma espécie química ativa (ou não). O resultado consiste em bloquear o acesso direto ao eletrodo, inibindo alguns processos e promovendo outros em sua superfície. Esta atribuição e controle de novas propriedades físico-químicas tornam-se uma ajuda importante na seletividade e sensibilidade da análise. Esta modificação pode ser feita em redes de microeletrodos para produzir sensores químicos específicos muito pequenos ou em eletrodos tradicionais com a adição de um modificador de camada, espécie eletroativa que age como mediadora entre a solução e o eletrodo (substrato) na transferência de elétrons (figura 51). [165]
Figura 51: Modelo de funcionamento de um eletrodo com superfície modificada. Neste caso a redução da espécie oxidada O2 a R2 fica inibida pelo modificador.
O
1
R
1
O
2
R
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .e-
SUBSTRATO
MODIFICADOR
Existem diferentes métodos para a preparação dos diferentes tipos de eletrodos modificados: (A) Modificação Química: a espécie eletroativa é imobilizada na superfície do eletrodo por reação química (e.g. silanização), este método tem a tendência de produzir monocamadas, com a exceção da ligação química por polímeros; (B) Adsorção: quando uma solução modificadora é colocada sobre o eletrodo. A adsorção pode ser reversível ou irreversível e tem sido usada particularmente na preparação de eletrodos modificados por polímeros (e.g. polivinilpiridina, polivinilferroceno, porfirinas e ftalocianinas); (C) Eletroadsorção: a adsorção é efetuada com um potencial aplicado no eletrodo. A quantidade é uma função do tempo de deposição, sendo possível à formação de multicamadas; e (D) Plasma: geração de um vapor de átomos a serem ligados na superfície de um eletrodo, formando uma superfície ativada. O carbono é o mais utilizado porque a exposição a aminas ou etenos, por exemplo, resulta na formação de ligações químicas [150, 165].
A caracterização do eletrodo modificado pode ser efetuada por métodos eletroquímicos, espectroscópicos e microscópicos. Dos métodos eletroquímicos realça- se a voltametria cíclica, a cronocoulometria e impedância, que juntos permitem determinar o número de centros ativos redox, a condutividade do filme, a cinética dos processos de eletrodo, dentre outros. Uma das vantagens da utilização dos eletrodos modificados é a origem de correntes mais elevadas do que na ausência do modificador. Às vezes, ao colocar o eletrodo modificado numa solução contendo apenas o eletrólito suporte, observam-se apenas as características voltamétricas das espécies imobilizadas, fato extremamente importante em processos como a eletrocatálise. Em alguns casos pode ser feita a modificação do interior em vez da superfície do eletrodo, como nos eletrodos de pasta de carbono. O modificador, uma substância que reage preferencialmente com uma espécie a ser determinada é misturado com a pasta de carbono. O modo de ação é por catálise da reação ou por pré-concentração do analito na superfície antes da determinação. As aplicações dos eletrodos modificados são as mais diversas, desde a catálise de reações orgânicas e inorgânicas até a transferência eletrônica para moléculas de interesse biológico. [150, 165]
Muitos sensores amperométricos baseados em enzimas estão disponíveis no mercado, como por exemplo, o sensor de glicose para determinação glicêmica no
sangue. Sobre o eletrodo de trabalho é colocado a enzima glicose oxidase que catalisa a oxidação da glicose em ácido glucônico e H2O2, na presença de oxigênio. O peróxido
de hidrogênio gerado difunde-se através da superfície do eletrodo e é oxidado para formar oxigênio num potencial constante aplicado em + 0,60 V em relação ao eletrodo de referência (Ag/AgCl (sat)). A corrente limite é proporcional a concentração de H2O2
que por sua vez é proporcional a concentração de glicose no sangue [166, 167].
H
2O
2O
2+
2H
++
2e
-É com base neste princípio que o teor de H2O2 nas amostras de mel foi
determinado na presença da enzima peroxidase, imobilizada em resina em um reator tubular acoplada a um sistema de análise em fluxo. Os procedimentos de imobilização e o sistema FIA associado aos detectores amperométricos foram descritos nos itens 4.2.3. e 5.2.3, respectivamente.
A medida amperométrica diferencial requer no mínimo 3 determinações:
i
A: Injeção da amostra + padrão de H2O2 no sistema sem a enzima peroxidaseimobilizada;