ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ( SDS-PAGE)

Os perfis eletroforéticos dos extratos de cerdas da lagarta L. obliqua dos

lotes A, B e C, em diferentes tempos de armazenamento, em condições reduzidas (com 2β-mercaptoetanol), estão apresentados nas figuras 22, 23 e 24, respectivamente.

As massas moleculares das proteínas dos extratos das cerdas dos lotes A, B e C nos diferentes tratamentos, em condições reduzidas, foram analisadas por densitometria. O parâmetro utilizado para a comparação entre as bandas protéicas foi porcentagem da densidade das bandas (% banda).

Na análise densitométrica foi possível diferenciar 21 bandas, porém nas tabelas 9, 10 e 11 estão apresentadas apenas as bandas consideradas como as prováveis proteínas relatadas na literatura, como o Lopap 69 kDa, ativador de protrombina (Reis et al., 1999), proteína com atividade de fator Xa de

aproximadamente 21 kDa (Lilla et al., 2005), e proteína com atividade fosfolipase

de 15 kDa (Seibert et al., 2006).

Embora o perfil eletroforético do extrato de cerdas nos géis (figuras 22, 23 e 24) parece não apresentar diferenças em relação à intensidade das bandas, a análise densitométrica mostrou diferenças sugestivas de degradação protéica (tabela 9, 10 e 11).

As diferenças nas porcentagens de banda foram observadas nos 3 lotes avaliados entre as amostras dos extratos com cerdas não congeladas (0) e com cerdas congeladas por 6 meses. No lote A (tab. 9), foi observada redução de 34% na porcentagem da banda 5 e de 22% e 24% nas bandas 18 e 19, respectivamente. No lote B (tab. 10), esta diferença também ocorreu na banda 5 (39%) e na banda 17, (21%). No entanto, a maior redução da porcentagem da banda 5 (60%), foi observada no lote C (tab. 11). Neste último lote houve redução também da porcentagem nas bandas 4 (21%), 11 (30%), 12 (27%) e 16 (34%).

Lote A Lote B 200 kDa 200 kDa 116 kDa 116 kDa 97 kDa 97 kDa 66 kDa 66 kDa 45 kDa 45 kDa 31 kDa 31 kDa 21 kDa 21 kDa 14 kDa 14 kDa 6,5 kDa 6,5 kDa 0 2 4 6 C P 0 2 4 6 P

Figura 22- Perfil eletroforético das proteínas dos extratos das cerdas da lagarta L. obliqua do lote A em

condições reduzidas: 0 meses, 2 meses, 4 meses e 6 meses; C- controle; P- padrão.

Figura 23- Perfil eletroforético das proteínas dos extratos das cerdas da lagarta L. obliqua do

lote B em condições reduzidas: 0 meses, 2 meses, 4 meses e 6 meses; P- padrão. Lote C 200 kDa 116 kDa 97 kDa 66 kDa 45 kDa 31 kDa 21 kDa 14 kDa 6,5 kDa 0 2 4 6 P

Figura 24- Perfil eletroforético das proteínas dos extratos das cerdas da lagarta L. obliqua do lote C em

condições reduzidas: 0 meses, 2 meses, 4 meses e 6 meses; P- padrão.

Tabela 9. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta

Lonomia obliqua (Lote A) expressos em porcentagem. Região das proteínas

procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 14 a 16 (fator Xa – 21 kDa); bandas 17 a 19 (Fosfolipase A2 – 15 kDa).

Banda Tempo de congelamento (meses)

(%) Peso molecular 0 2 4 6 kDa 3 5.52 6.19 6.01 4.86 76,73 4 2.76 2.49 2.42 2.32 67,48 5 4.15 4.72 4.02 2.72 60,45 14 4.01 3.19 3.67 3.63 21,08 15 4.70 5.17 4.21 4.04 20,67 16 4.96 3.64 4.86 5.59 19,64 17 1.95 3.72 4.13 4.21 18,85 18 17.1 16.1 13.4 13.4 17,5 19 12.7 11.9 14.0 15.7 13,5

Tabela 10. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta

Lonomia obliqua (Lote B) expressos em porcentagem. Região das proteínas

procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 12 a 14 (fator Xa – 21 kDa); bandas 16 a 18 (Fosfolipase A2 – 15 kDa).

Banda Tempo de congelamento (meses)

(%) Peso molecular 0 2 4 6 kDa 3 3,4 5,16 5,4 3,64 83,92 4 2,91 3,48 3,18 2,48 69,18 5 2,79 4,42 4,32 3,87 61,79 12 2,97 2,77 4,07 3,23 22,29 13 8,26 10,4 8,94 8,3 18,14 14 3,92 4,34 3,31 3,52 17,17 16 5,06 6,75 4,92 4,18 15,83 17 3,31 3,39 4,32 2,61 15,42 18 15,2 14,8 14,4 15,6 14,99

Tabela 11. Dados parciais da análise densitométrica da eletroforese em gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) das amostras de extrato das cerdas da lagarta

Lonomia obliqua (Lote C) expressos em porcentagem. Região das proteínas

procoagulantes- bandas 3 a 5 (Lopap - 69 kDa) e 11 a 13 (fator Xa – 21 kDa); bandas 16 a 18 (Fosfolipase A2 – 15 kDa).

Banda Tempo de congelamento (meses)

(%) Peso molecular 0 2 4 6 kDa 3 4,6 5,13 5,94 4,41 80,26 4 3,24 3,27 3,15 3,91 67,01 5 3,99 4,38 3,54 6,39 58,7 11 3,34 3,24 2,54 4,35 28,2 12 2,14 2,21 2,29 2,72 21,63 13 9,57 8,18 9,82 7,66 17,81 16 6,25 4,3 4,44 4,14 15,54 17 2,8 3,15 2,85 2,49 15,19 18 13,37 16,6 15,1 15,5 14,74

V. DISCUSSÃO

A dificuldade na obtenção de um número considerável de espécimes de

Lonomia obliqua, aliado ao custo no transporte destas, pode acarretar em fator

limitante para a preparação de soro anti-lonômico. Assim, decidimos realizar este estudo para avaliar a viabilidade de congelamento das cerdas destes animais a fim de facilitar a aquisição de matéria-prima para preparação do antiveneno.

Os nossos estudos mostram que o congelamento e o armazenamento das cerdas da lagarta Lonomia obliqua por até 6 meses, pode alterar alguns

parâmetros do extrato, tais como: concentração das proteínas, a atividade procoagulante e a atividade fosfolipásica. Por outro lado, nenhuma alteração foi observada na atividade hemolítica indireta e na resposta imunogênica entre as amostras de cerdas não congeladas e congeladas neste material. Além disso foi verificada ausência da atividade fibrinolítica e atividade hemolítica direta.

Na dosagem de proteínas, verificamos que houve redução significativa da concentração protéica das amostras preparadas com cerdas congeladas por 6 meses, quando comparada às amostras de cerdas não congeladas. Enquanto que os lotes A e C apresentaram diminuição da concentração protéica no sexto mês, o lote B apresentou redução desde o segundo mês de congelamento. Esta redução da concentração de proteína pode estar relacionada com a degradação das proteínas, através da quebra das suas ligações peptídicas, causada provavelmente pelas enzimas presentes nas cerdas.

A dosagem bioquímica de proteínas também pode ser realizada através da quantificação de anéis aromáticos por espectrofotometria em A280, pela quantificação das ligações peptídicas por biureto ou ambos, pelos métodos de Bradford ou Lowry (Boyer, 1986). Quando as proteínas são degradadas, ocorrem quebras das ligações na estrutura primária da proteína (ligações covalentes). Consequentemente, com a diminuição do número de ligações peptídicas, diminuem o número de interações com o cobre, levando a diminuição da absorbância, já que o método de Markwell et al.,1978 é um ensaio colorimétrico.

As proteínas possuem estrutura tridimensional, determinada pela seqüência de aminoácidos, e que representa uma determinada conformação espacial importante para a sua função. A estrutura tridimensional de uma proteína

é única, e as forças mais importantes que a estabilizam são as suas interações não covalentes (Lehninger et al., 1995).

As estruturas das proteínas (figura 25) podem ser descritas como:

1) estrutura primária que inclui todas as ligações covalentes entre os aminoácidos, é definida pela seqüência dos aminoácidos unidos por ligações peptídicas e pela localização das pontes de dissulfeto;

2) estrutura secundária são arranjos regulares e recorrentes no espaço, de resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. As estruturas mais conhecidas são: a estrutura em α-hélice e a conformação β;

3) estrutura terciária é o relacionamento espacial entre todos os aminoácidos em um polipeptídio. A diferença entre estrutura secundária e terciária não é clara, pois vários tipos diferentes de estrutura secundária são freqüentemente encontrados no interior da estrutura tridimensional de uma proteína grande;

4) estrutura quaternária possui várias cadeias polipeptídicas, tem um nível de estrutura a mais, e não especifica a relação espacial dos polipeptídios, ou subunidades no interior de uma dada proteína (Lehninger et al, 1995).

Figura 25. A figura mostra a representação das estruturas conformacionais das

proteínas (foto retirada do site www.icb.ufmg.br)

Em 1920 foram iniciados os principais estudos sobre as estruturas protéicas, sua função e estabilidade, nessa época os métodos de estudos eram mais limitados do que atualmente onde a cristalografia e raio-X possibilitaram

melhor conhecimento sobre a estrutura. Verificou-se assim que existe uma relação entre a estrutura da proteína e a atividade in vitro ou função que

desempenha in vivo (Franks, 2002).

O termo desnaturação aplica-se a processos que não envolvem ruptura de ligação peptídica, mas que levam a mudança na estrutura tridimensional da proteína que, por sua vez, está associada à perda da função (Hatley & Franks, 1989 a, b; Franks, 2002).

Os fatores que podem levar à desnaturação das proteínas são: aquecimento, valores extremos de pH e alguns solventes orgânicos miscíveis tais como água, etanol, acetona, substâncias em solução como uréia e substâncias detergentes. Esses agentes representam um tratamento relativamente suave, já que não quebram nenhuma ligação covalente na cadeia polipeptídica. Solventes orgânicos, uréia e detergentes agem primariamente na ruptura de interações hidrofóbicas; valores extremos de pH alteram carga líquida da proteína, provocando repulsão eletrostática e rompimento de algumas pontes de hidrogênio (Franks et al., 1988).

Em algumas proteínas a desnaturação em altas temperaturas promove ruptura das pontes de dissulfeto ou intercâmbio de dissulfeto (particularmente em pH alcalino), mas, geralmente, somente interações não covalentes são afetadas pelo calor. Algumas enzimas podem ser inativadas por exposição ao frio, mas na maioria dos casos elas podem ser reativadas, quando aquecidas adequadamente (Hatley & Franks, 1989a; Hatley & Franks, 1989b, Franks, 2002).

Como podemos observar, o processo de desnaturação está intimamente ligado à atividade biológica. No nosso caso, as condições de congelamento e armazenamento das cerdas das lagartas provavelmente induziram a desnaturação de algumas proteínas conforme os resultados obtidos para dose mínima coagulante e atividade fosfolipásica, nas quais observamos reduções significativas da atividade dos extratos preparados com as cerdas congeladas. No lote A, a capacidade do extrato de coagular o plasma diminuiu nas amostras de 2 meses, mantendo-se constante até o quarto mês e, com 6 meses de congelamento, houve uma nova redução de atividade, quando comparada com a amostra do extrato de cerdas não congeladas (0 meses). Com relação à atividade fosfolipásica as amostras apresentaram redução a partir de 2 meses, sofrendo

redução progressiva com 4 e 6 meses de congelamento. No lote B, em relação a atividade procoagulante, as amostras apresentaram redução de atividade no quarto e sexto mês de congelamento, quando comparados às amostras de 0 e 2 meses, que tiveram comportamento semelhante. Em relação à atividade fosfolipásica deste lote, as amostras apresentaram comportamento similar ao observado para atividade coagulante. No lote C, as atividades procoagulante e fosfolipásica apresentaram redução de atividade a partir do segundo mês de congelamento que se manteve constante até o sexto mês, quando comparada à amostra não congelada.

Essa diminuição de atividades pode estar relacionada com a desnaturação de proteína devido ao congelamento das cerdas. Como mostram os trabalhos de Hatley & Franks (1989a, 1989b); Franks, 2002; Cao et al. (2003) e Jiang & Nail

(1998), o processo de congelamento é capaz de desnaturar proteína, e reduzir as atividades biológicas.

Não há estudos sobre os efeitos de diferentes condições de armazenamento do extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, porém, há

estudos que mostram a influência da temperatura sobre a estabilidade de proteínas do veneno de serpentes (Kurth & Aurich, 1976; Munekiyo & Mackessy, 1998; Aung et al., 1999). Munekiyo & Mackessy (1998) estudaram os efeitos de

diferentes condições de armazenamento sobre a estabilidade do veneno, em ensaios eletroforéticos, de toxicidade e atividade enzimática. De modo geral, foi observado que o veneno da serpente Crotalus molussus molussus se apresentou

estável para a maioria das amostras, nas diferentes condições de armazenamento, havendo variação somente entre os ensaios enzimáticos. Os autores acreditam que a estabilidade do veneno das serpentes frente a diferentes condições de armazenamento pode estar relacionada a estabilizadores ou inibidores endógenos presentes na glândula e no veneno armazenado no lúmen.

Além das diferenças observadas entre as amostras (0, 2, 4 e 6 meses) dentro de um mesmo lote, constatamos também que ocorreu uma variação entre diferentes lotes (A, B e C). Esta diferença de comportamento pode ser explicada por elas terem sido preparadas em épocas diferentes, ou mesmo, por estresse das lagartas provocado pelo transporte. As amostras do lote A apresentaram comportamento mais uniforme, com diminuição progressiva da atividade ao longo

do tempo de congelamento das cerdas. O lote A foi processado em Passo Fundo, onde foi preparado o extrato de cerdas não congeladas. Em seguida as cerdas foram congeladas, transportadas para o Instituto Butantan e mantidas a -20ºC por 2, 4 e 6 meses, para posterior preparação do extrato. Por outro lado, as amostras dos lotes B e C foram preparadas no Instituto Butantan sendo as lagartas transportadas vivas até São Paulo, por via rodoviária. As lagartas permaneceram no laboratório de Parasitologia do Instituto Butantan, onde passaram por uma triagem. As lagartas doentes foram separadas das lagartas sadias. As lagartas sadias foram mantidas por dois a três dias em caixas de acrílico (“glove box” adaptadas) medindo 120 x 60 x 60 cm, com tampa superior e aberturas circulares teladas. As lagartas foram alimentadas com folhas de nêspera, e o processamento das cerdas seguiu o mesmo tratamento do lote A. Os lotes B e C apresentaram comportamento variável para atividade procoagulante e hemolítica, sendo que o lote B apresentou diminuição desta atividade a partir do quarto mês mantendo-se assim até o sexto mês. Já o lote C apresentou redução com 2 meses que se manteve nos meses seguintes. Além disso, em relação à atividade fosfolipásica, as amostras dos lotes B e C apresentaram atividade significativamente menor, quando comparadas à do lote A. Embora não tenha sido feito nenhum trabalho para avaliar a influência do estresse sobre as toxinas da lagarta, os nossos resultados indicam a possibilidade do estresse ser um fator que interfire com as atividades destas proteínas.

Em relação à atividade hemolítica direta in vitro, não observamos esta

atividade em nenhuma das amostras nos diferentes lotes testados. Entretanto, os estudos de Seibert et al. (2003) mostram claramente a presença dessa atividade

encontrada em várias preparações de extrato. A ausência de atividade hemolítica direta nos três lotes pode estar relacionada a fatores como variação regional, climática e alimentação, observada em muitas toxinas de animais (Gubensek et al., 1974; Aragon & Gubensek, 1981; Glenn et al., 1982; Minton & Weinstein,

1986). Porém, não sabemos exatamente quais os fatores que podem influenciar na sua expressão, pois não há nenhum estudo específico com as toxinas desta lagarta.

A atividade hemolítica indireta não apresentou diferença significativa entre as amostras de um mesmo lote e, mesmo entre os diferentes lotes. A substância

responsável pela atividade hemolítica indireta é a fosfolipase A2 (Seibert et al., 2006). A fosfolipase A2 é capaz de hidrolisar as fosfatidilcolinas e fosfatidiletanolaminas exógenas (lecitina), com a liberação de ácido graxo e formação de lisoderivados (lisolecitina). Esses compostos tensoativos alteram a permeabilidade da membrana celular ocasionando hemólise, considerada indireta (CONDREA, 1979). A ausência de diferença significativa na atividade hemolítica

indireta, mesmo tendo sido observada diminuição importante da atividade fosfolipásica, pode ser decorrente da metodologia utilizada para a determinação da atividade. Foram utilizados 60 minutos de incubação das hemácias com o extrato. Esse tempo longo de incubação, provavelmente, compensou a diferença da quantidade de fosfolipase nas amostras de cerdas congeladas e que foi suficiente para desestruturar a membrana celular e levar ao seu rompimento.

Em relação à atividade fibrinolítica, esta não foi observada nas nossas amostras, corroborando os resultados descritos no trabalho de Fritzen et al.

(2003). Porém, Veiga et al. (2003), verificaram atividade fibrinogenolítica no

extrato bruto de cerdas de L. obliqua.

Os conhecimentos existentes sobre a biologia da lagarta Lonomia obliqua

não permitem ainda explicar as diferenças de atividades observadas neste estudo, pois, não há estudos sobre a variação ontogenética, regional, climática, ou mesmo alimentar, relacionado com atividades biológicas do extrato de cerdas.

Marval et al. (1999), verificaram em seus experimentos que alguns lotes de

hemolinfa (preparados com lagartas da Lonomia achelous no 3º e 4º instar), não

ativaram plasminogênio e não afetaram a atividade de fator XII em coelhos. Eles atribuíram essas variações como sendo dependentes dos estágios de desenvolvimento das lagartas de Lonomia achelous, relatando também a

dificuldade em determinar o estágio de desenvolvimento ou instar exato do animal na coleta. Foi mencionada também a influência do estágio de desenvolvimento sobre a atividade fibrinolítica direta e ativador de plasminogênio, observado apenas em animais do 1º ao 3º instar (Arocha-Piñango & Guerreo, 1999). Devemos salientar que em nosso trabalho, foram utilizadas lagartas no último estágio de desenvolvimento (larvas de 5º e 6º instar), identificadas pelo entomologista Roberto H. Moraes do laboratório de parasitologia do Instituto Butantan. Porém, Veiga et al. (2003) que mostraram atividade fibrinolítica nos

extratos de cerdas da L. obliqua, não referem o estágio das larvas utilizadas

dificultando assim uma conclusão definitiva.

É importante considerar que os métodos de preparação do extrato utilizados por diferentes grupos não são iguais e todos eles apresentam uma mistura complexa de várias proteínas que não estão relacionadas apenas com a atividade tóxica das cerdas. Pelas características das cerdas destas taturanas que não permitem a identificação de uma glândula especializada como a da serpentes peçonhentas (Veiga et al., 2001), a extração das toxinas, sem o

preparo do macerado, ainda é inviável. Assim, possivelmente algumas diferenças de atividades encontradas nos diferentes trabalhos podem ser ocasionadas por diferenças na preparação do extrato. Não podemos deixar de considerar o fato de que em Lonomia achelous, esta atividade fibrinolítica é bastante significativa e

parece ser uma das principais atividades no envenenamento humano, de tal forma que, muitos pacientes acidentados por esta espécie foram tratados e recuperados com anti-fibrinolíticos (Arocha-Piñango et al., 1992). Assim, parece

bastante evidente que existem diferenças de atividade entre Lonomia achelous e Lonomia obliqua, principalmente relacionado com o sistema fibrinolítico.

O tratamento com antiveneno anti-lonômico foi iniciado no Brasil em 1994, cerca de 5 anos após o início dos acidentes na região Sul, com a lagarta Lonomia obliqua (Fan, 2002). Alguns tratamentos realizados com anti-fibrinolíticos, em

pacientes internados no Hospital São Vicente de Paulo em Passo Fundo-RS, não apresentaram resultados satisfatórios (Fan, 2002), mostrando que possivelmente para acidentes com L. obliqua a atividade fibrinolítica não é tão importante como

para L. achelous.

Embora não haja estudos sobre a influência desses fatores na composição das toxinas do extrato que possam reforçar ou mesmo esclarecer os nossos resultados, Marval et al. (1999) e Arocha-Piñango & Guerrero (1999)

mencionaram a possível participação ontogenética na composição das toxinas presentes no extrato. Assim, as diferenças observadas na composição das toxinas presentes no extrato, possivelmente, podem ser influenciadas por vários fatores como variação individual, geográfica, sazonal e climática, alimentar, intra e interespécies e ontogenética. Existem vários trabalhos mostrando a influência desses fatores na composição e atividade do veneno de serpentes. Em relação à

variação ontogenética, foram observadas diferenças quantitativas e qualitativas na composição do veneno de filhotes e adultos de serpente (Bonilla et al., 1973;

Meier & Freyvogel, 1980; Lomonte et al., 1983; Gutierrez et al., 1990 e Furtado et al., 1991). Foi mostrada também a influência da sazonalidade na composição do

veneno, que pode variar de acordo com a época do ano, levando a ausência de duas frações letais nas amostras de inverno observadas por eletroforese (Bertand & Vladesco, 1942 e Gubensek et al., 1974). Outro fator descrito foi a influência da

variação geográfica na composição do veneno (Glenn & Straight,1978; Aragon & Gubensek, 1981; Glenn et al., 1982; Minton & Weistein, 1986 e Rodrigues et al.,

1998).

Nas serpentes, o veneno tem função importante na alimentação (Hayes, 1991). A função do veneno é auxiliar na apreensão da presa, cuja dieta varia com a idade. Os jovens preferem pequenos ectotérmicos (anuros, lagartos) e os adultos, da maioria das espécies, se alimentam quase exclusivamente de endotérmicos (pássaros e roedores). As propriedades biológicas do veneno auxiliam na imobilização e posterior morte da presa, portanto, a proporção e a composição do veneno, assim como o comportamento e a dieta, contribuem para o sucesso da predação (Hayes, 1991).

Ao contrário das serpentes, cujo veneno é produzido em um sistema secretor, e possui uma finalidade de defesa e alimentação, pouco se sabe sobre as toxinas das lagartas. Ainda não sabemos se há algum tecido especializado para produção das toxinas, qual a função dessas toxinas para a lagarta, e os fatores que podem influenciar na sua composição. Assim, as variações de atividades observadas nos extratos de cerdas da Lonomia ainda são pouco

compreendidas.

O perfil eletroforético do extrato de cerdas das amostras 0, 2, 4 e 6 meses, aparentemente não apresenta diferenças na intensidade das bandas protéicas. Entretanto, ao quantificarmos as porcentagens das bandas observamos diferenças sugestivas de degradação de proteína, alterando assim seu peso molecular e levando ao aparecimento de novas bandas ou mesmo sobreposição das bandas já existentes. Porém, o grande número de proteínas presentes no extrato bruto de cerdas da lagarta L. obliqua, é um fator que interfere em uma

outras, dificultam uma marcação mais precisa e, além disso, há dificuldade em identificar as proteínas que estão sendo degradadas, pois ao serem quebradas as mesmas geram fragmentos que podem se sobrepor a outras bandas. Este processo de degradação protéica pode estar contribuindo na redução das atividades biológicas avaliadas.

Em relação à resposta imunológica, os extratos preparados com cerdas não congeladas e com cerdas congeladas por 6 meses, inoculados nos camundongos não apresentaram diferença significativa em relação a produção de anticorpos. Os anticorpos anti-lonômico, produzidos com cerdas não congeladas e congeladas até 6 meses, reconheceram igualmente, por ELISA, tanto o extrato de cerdas não congeladas como o congelado por 6 meses. Assim, optamos por utilizar o extrato de cerdas não congelado para sensibilização das placas. Os resultados mostraram que, mesmo com atividade biológica reduzida, o extrato preparado com cerdas congeladas por 6 meses foi capaz de induzir resposta imune, e os anticorpos foram capazes de reconhecer tanto o extrato controle (preparado com cerdas não congeladas), como o extrato que sofreu desnaturação (preparado com cerdas congeladas por 6 meses). Estes resultados já eram esperados, pois a imunogenicidade de um antígeno nem sempre está relacionada à sua atividade biológica, tanto que substâncias inativadas podem continuar sendo excelentes imunógenos com capacidade de produzir anticorpos específicos. Rangel-Santos & Mota (2000), em um estudo sobre os efeitos do aquecimento sobre toxicidade e atividade imunogênica e imunossupressiva do veneno de Crotalus durissus terrificus, observaram que a desnaturação por