A tipificação molecular foi realizada pela técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (Pulsed-field gel electrophoresis - PFGE) conforme descrito por Gautom (1997). Colônias isoladas foram cultivadas em TSB (Oxoid, Inglaterra) e incubadas a 37ºC overnight. As células foram lavadas em tampão SE (NaCl 75mM, (Sigma-Aldrich, Alemanha) pH 8.0; EDTA 25mM, pH 8.0 (USB, Germany)), e ressuspensas no mesmo tampão de forma que a suspensão resultante correspondesse a escala 3 de McFarland, equivalente a aproximadamente 9 x108 bactérias/mL. Duzentos microlitros da suspensão de células foram adicionados a 200L de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% (Sigma-Aldrich, Alemanha) em tampão TE (Tris 10mM (Promega, EUA), EDTA 0,1mM (USB, Germany)) a 55C. A mistura foi homogeneizada e distribuída em moldes de discos com 20L. A suspensão de células foi inserida no disco de agarose, que foi então transferido para tubos contendo 1 mL de solução de lise (Tris 50mM pH 8,0 (Promega, EUA); EDTA 50mM pH 8,0 (USB, Germany); sarcosina 1% (Sigma-Aldrich, Alemanha); proteinase K 1mg/mL (Thermo Scientific, EUA) e incubado a 55C overnight. A solução de lise foi removida e os discos foram lavados 10 vezes com tampão TE (Tris 10mM (Promega, EUA); EDTA 0,1mM pH 8,0 (USB, Germany)) a 37C por pelo menos 30 minutos. Um a dois discos foram removidos e tratados com 10U da endonuclease de restrição XbaI (Thermo Scientific, EUA) overnight a 37C. Os fragmentos de restrição foram separados em gel de agarose a 1,2% preparado em tampão TBE 0,5x (Tris 44,5mM (Promega, EUA); ácido bórico 44,5mM (Vetec, Brasil); EDTA 12,5mM (USB, Germany); tiouréia 200µM; pH 8,0) por eletroforese de campo alternado usando o aparelho CHEF-DR III (Bio-Rad, Richmond, EUA). As seguintes condições para a eletroforese foram utilizadas: tempo de pulso crescente de 2,2 a 54,2 segundos, por 22 horas a 6V/cm, na temperatura de 14C, com ângulo de 120. A separação dos fragmentos de DNA foi visualizada em um transiluminador após tratamento com brometo de etídio 1 μg/mL (GAUTOM, 1997).
O dendrograma com o perfil de bandas dos géis foi gerado com o software Gelcompar II (Applied Maths, Bélgica), utilizando o coeficiente de Dice com tolerância de 1,5% pelo método UPMGA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) para produzir os agrupamentos entre as amostras.
4.3 PCR
4.3.1
EXTRAÇÃO DO DNA TOTALO ácido desoxirribonucleico (DNA) total foi obtido coletando-se uma colônia bacteriana isolada e crescida por 24h em TSA (Oxoid, Inglaterra) a 37°C, a qual foi suspensa em 100µL de água MiliQ estéril e homogeneizada em agitador tipo vórtex por 1 minuto. Após centrifugação a 2000 x g por 1 minuto, 20L do sobrenadante foram armazenados a -20°C para as reações em cadeia da polimerase (PCR).
Os iniciadores e as condições das reações de PCR estão descritos na tabela 1. Como controle interno das reações de PCR, foi utilizado o iniciador para determinar a presença do gene que codifica o RNA ribossômico 16S (AHN et al., 2006).
4.3.2
CONDIÇÕES REACIONAIS DAS PCR4.2.2.1 Tipificação Filogenética
Foi realizada de acordo com Clermont, Bonacorsi e Bingen (2000). Foi realizada uma PCR multiplex com o conjunto de iniciadores descritos na tabela 1. Todos os reagentes utilizados nas reações de PCR foram fornecidos pelo mesmo fabricante (Thermo Scientific, EUA). As condições utilizadas: 5 min a 94°C; 30 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 55°C e 30 seg a 72°C; e uma etapa final de extensão de 7 min a 72°C. As reações foram realizadas em um volume total de 25µL, contendo tampão de reação 1 vez concentrado, 1,5 mM de MgCl2, 1,25U de enzima Taq DNA polimerase (10U/µL), mistura de dNTPs (200 μM, concentração final de cada), 20 pmol de cada iniciador e 3 μL do preparado contendo DNA bacteriano.
4.2.2.2 Detecção dos genes de virulência iucC, fyuA, hlyC e cnf1
A reação de PCR foi realizada em um volume final de 25 μL, contendo tampão de reação 1 vez concentrado, 1,5mM de MgCl2, 1,25U de enzima Taq DNA
polimerase, mistura de dNTPs (200 μM, concentração final de cada), 10pmol para os iniciadores iucC e cnf1 e 20pmol para fyuA e hlyC e 5 μL do preparado contendo DNA bacteriano. Os iniciadores utilizados neste experimento estão descritos na tabela 1 e foram anteriormente descritos por Bonacorsi et al. (2006) e Bingen-Bidois et al. (2002). Na reação de amplificação, foi realizada a técnica de “touchdown” em um termociclador programado para desnaturação inicial de 95ºC por 5 min, seguido de 10 ciclos de 94ºC por 30 seg, 60ºC (Δ = - 0,5°C) por 90 seg e 72ºC por 90 seg, em seguida 20 ciclos de 94ºC por 30 seg, 55°C por 90 seg e 72ºC por 90 seg, e extensão final de 72ºC por 10 min.
4.2.2.3 Detecção dos genes qnrA, qnrB e qnrS
A detecção dos genes qnrA, qnrB, e qnrS foi realizada usando os iniciadores apresentados na tabela 1, em uma PCR uniplex “touchdown” com as condições: 95°C durante 3 min, 12 ciclos de 94°C durante 1 min, 60°C (Δ = - 0,5°C) durante 30seg, 72°C durante 1 min, 23 ciclos de 94°C durante 1 min, 54°C durante 30 seg, 72°C durante 1 min, e 72°C durante 5 min (CHRISTIANSEN et al, 2011).
A PCR foi realizada em um volume final de 25μL, contendo tampão de reação 1 vez concentrado, 1,5mM de MgCl2, 1,25U de enzima Taq DNA polimerase, mistura de dNTPs (200 μM, concentração final de cada), 20pmol de cada iniciador e 3μL do preparado contendo DNA bacteriano.
4.2.2.4 Detecção do gene variante aac(6’)-Ib-cr
A detecção do gene de aac(6’)-Ib foi realizada nas seguintes condições: 94°C por 3 min, 35 ciclos de (94°C por 45 seg, 55°C por 45 seg, 72°C por 45 seg), e 72°C por 3 min (PARK et al, 2006; CHRISTIANSEN et al, 2011).
A PCR foi realizada em um volume final de 25μL, contendo tampão de reação 1 vez concentrado, 1,5mM de MgCl2, 1,25U de enzima Taq DNA polimerase, mistura de dNTPs (200 μM, concentração final de cada), 20pmol de cada iniciador e 3μL do preparado contendo DNA bacteriano.
Os produtos de PCR foram purificados e digeridos com 10U da enzima de restrição NdeI (Thermo Scientific, EUA) para identificar a variante aac(6’)-Ib-cr, que possui este sítio de restrição (ausente na forma original da aac(6’)-Ib), gerando assim dois fragmentos de 453 e 66 pares de base, respectivamente (JONES et al., 2008). Assim, volume de 30µL da mistura contendo 10µL do produto de amplificação, 1µL de enzima NdeI (10U), 2µL de tampão de reação e 17µL de água estéril, foi incubado a 37°C por 16 horas.
4.2.2.5 Detecção do gene qepA
A detecção do gene qepA, que codifica para uma bomba de efluxo, foi realizada de acordo com Cattoir, Poirel e Nordmann (2008).
As condições utilizadas foram: 3 min a 94°C; 30 ciclos de 30 seg a 94°C, 30 seg a 55°C, e 30 seg a 72°C; e uma etapa final de extensão de 3 min a 72°C.
A PCR foi realizada em um volume final de 25μL, contendo tampão de reação 1 vez concentrado, 1,5mM de MgCl2, 1,25U de enzima Taq DNA polimerase, mistura de dNTPs (200 μM, concentração final de cada), 20pmol de cada iniciador e 3μL do preparado contendo DNA bacteriano.
4.3.3
ELETROFORESE DO PRODUTO DA AMPLIFICAÇÃOTodos os fragmentos de DNA amplificados foram submetidos à eletroforese convencional, em gel de agarose a 2% (p/v) (Sigma-Aldrich,). Uma alíquota de 2μL do padrão de corrida DNA Ladder (100 pb; Invitrogen) foi adicionada a 4μL de tampão de amostra [azul de bromofenol a 0,25% (p/v; Dinâmica, Brasil); glicerol a 30% (p/v; Vetec, Brasil)] e o volume total aplicado em uma canaleta do gel. Alíquotas de 8μL do produto da reação de PCR foram acrescidas de 3μL do mesmo tampão de amostra e aplicadas em diferentes canaletas. Em seguida, o gel foi submetido à eletroforese em tampão TBE 0,5x (Tris 44,5mM (Promega, EUA), ácido bórico (Vetec, Brasil), 44,5mM, EDTA 12,5mM (USB, Germany) pH 8,0, por 90 min a 90 volts. Após a eletroforese, o gel foi tratado com brometo de etídio,1 μg/mL e os
amplicons visualizados em transiluminador de luz ultravioleta. O registro do padrão de bandas produzido pela eletroforese foi realizado por fotografia.