Eletroforese de Isoenzimas

Dentre os eventos bioquímicos e fisiológicos, que levam à perda de qualidade das sementes, e em consequência, à perda de viabilidade das mesmas, destacam-se as aberrações cromossômicas, danos de DNA (BEWLEY; BLACK, 1994) e mudanças em enzimas e proteínas de reserva (BAILLY, 2004).

A eletroforese vem sendo utilizada no estudo de proteínas e isoenzimas com relação, não apenas às mudanças na qualidade fisiológica de sementes, mas também nas regulações gênica, bioquímica e ontogênica, entre outros.

Em fisiologia de sementes, as espécies reativas de oxigênio (ERO’s) são geralmente consideradas como moléculas tóxicas. Elas são responsáveis pelos danos oxidativos em biomoléculas, como o ácido desoxirribonucléico (DNA), carboidratos, lipídeos e proteínas. A acumulação de ERO’s ocasiona lesões à célula e distúrbios no desenvolvimento de sementes e no processo de germinação (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989).

As ERO’s podem ser tanto radicais, que são moléculas contendo um ou mais elétrons não pareados, quanto não radicais. As mais relevantes são: o ânion superóxido (O2-), o radical hidroxil (OH), o oxigênio singlet (O2) e peróxido de

hidrogênio (H2O2) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1989). O ânion superóxido

(O2-) é uma molécula com elétron desacoplado e pode reagir com outras

moléculas para estabilizar a sua energia. O superóxido é formado, continuamente, em processos celulares, incluindo os sistemas microssomal e mitocondrial de transporte de elétrons. As células contêm um complexo de transferência de elétrons associado à membrana plasmática, a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, que reduz o oxigênio com a NADPH produzindo o ânion superóxido. A formação do superóxido está relacionada à “explosão oxidativa” durante interações planta-patógeno (GRANT; LOAKE, 2000; LAMB; DIXON, 1997), no crescimento da planta e

vários processos de desenvolvimento (SCHOPFER; PLACHY; FRAHRY, 2001), e em respostas das plantas a várias formas de estresse abiótico (NEILL; DESIKAN; HANCOCK, 2002). Esse radical é considerado uma espécie pouco reativa porque não se difunde por distâncias consideráveis a partir do seu sítio de produção, porém pode combinar com outras espécies formando uma espécie mais reativa (FANG; YANG; WU, 2002; THOMAS, 2003).

O peróxido de hidrogênio (H2O2) é gerado pelas mesmas fontes que

produzem o ânion superóxido, pois tanto a destruição enzimática como a não enzimática deste produzem o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é considerado pouco reativo, pois não ataca diretamente os vários componentes celulares, mas pode difundir-se por meio de membranas e assim, atingir moléculas alvo a uma distância a partir do seu local de produção (THOMAS, 2003).

A reação do peróxido de hidrogênio com íons de ferro é chamada de reação de Fenton (1894) que leva à produção do radical hidroxil (OH). O radical hidroxil também pode ser formado a partir do ânion superóxido e do peróxido de hidrogênio na presença de um cátion de transição como o ferro (Fe++_{) ou cobre}

(Cu+_{) na reação de Haber-Weiss (1934) (BAILLY, 2004). O radical hidroxil é}

considerado a espécie mais reativa, pois é capaz de reagir com todas as biomoléculas produzindo derivados que não podem ser regenerados pelo metabolismo celular (DIPLOCK et al., 1998; THOMAS, 2003).

O oxigênio singlet (O2_{) é formado pela oxidação de outros}

intermediários reativos de oxigênio e constitui-se como um importante reativo no estresse oxidativo. Seus alvos preferenciais em reações químicas são as duplas ligações como em ácidos graxos poliinsaturados ou guanina em bases de DNA (DIPLOCK et al., 1998).

Para o controle dos níveis de ERO’s, existem a nível celular, os mecanismos de desintoxicação, ou seja, são mecanismos de eliminação,

funcionando em casos de tensões oxidativas. Algumas enzimas desempenham essas funções em plantas. A enzima superóxido dismutase (SOD) constitui-se como uma das enzimas mais importantes que atuam como antioxidante celular que pode ser mitocondrial, citosólica ou cloroplasmática, catalisa a conversão do ânion superóxido a peróxido de hidrogênio (reação de dismutação) (BOWLER; MONTAGU; INZÉ, 1992). O peróxido de hidrogênio é eliminado pela ação da catalase (CAT), que está localizado em glioxissomos e peroxissomos (WILLEKENS et al., 1995), como sítio ativo a catalase possui um grupo heme (Fe++_{) que catalisa a reação, cujo peróxido de hidrogênio é convertido em H}

2O e

O2.

A esterase (EST) é uma enzima envolvida em reações de hidrólise de ésteres, estando diretamente relacionada ao metabolismo dos lipídios (BRANDÃO JÚNIOR; VIEIRA; HILHOST, 2002; SANTOS; MENEZES; VILLELA, 2005; VEIGA et al., 2010). A redução da atividade da esterase impede que os fosfolipídios das membranas permaneçam eficientemente protegidos (HENNING et al., 2009), desse modo, o sistema de membranas das organelas fica comprometido, tornando-se mais suscetíveis aos efeitos deletérios do O2 e permitindo maior produção de lixiviados, à medida que as sementes

perdem a viabilidade (BEWLEY; BLACK, 1994).

As peroxidases (PO) são enzimas, que utilizam H2O2 para catalisar a

oxidação de compostos orgânicos e inorgânicos, entre eles os polifenóis.

Alto conteúdo dos polissacarídeos, celulose e hemicelulose, são encontrados em sementes de café, sendo que as principais hemiceluloses são as mananas e galacto-mananas insolúveis (BEWLEY; BLACK, 1994). Estes polissacarídeos são depositados como fonte de reserva nas sementes e são degradados no momento da germinação, pela ação de enzimas, incluindo a endo- β-mananase, β-manosidase, galoctosidase e celulase, resultando no enfraquecimento das paredes celulares do endosperma.

A presença da enzima endo-β-mananase é primordial no processo de germinação das sementes de café, cuja germinação é limitada pela presença do endosperma, existindo a necessidade de amolecimento desse tecido para que ocorra a protrusão radicular. A endo-β-mananase é uma das enzimas que desempenha o papel de amolecer o endosperma. Ela está presente em diferentes isoformas no endosperma , sendo duas dessas formas inibidas pelo ácido abscísico na fase de enfraquecimento do endosperma na região próxima à radícula (SILVA et al., 2004).

Enzimas envolvidas no processo de respiração como a álcool desidrogenase (ADH) e a malato desidrogenase (MDH), podem caracterizar e monitorar a qualidade fisiológica de sementes (VEIGA et al., 2010). A enzima MDH catalisa uma reação reversível do ciclo de krebs, atuando na conversão do malato em oxaloacetato. A enzima ADH catalisa a reação de formação do etanol, quando na glicólise, a célula se encontra em condição de anaerobiose, o piruvato transforma-se em acetaldeído e em seguida pela ação da ADH forma-se o etanol (TAIZ; ZAIGER, 2004).