ELISA de inibição

ELISA de inibição foi desenvolvido para avaliar o grau de reatividade cruzada entre T.

gondii e N. caninum como anteriormente descrito (PEREIRA et al., 2005). Soros de cães

positivos a ambos parasitos foram utilizados e diluições ótimas do soro foram previamente estabelecidas a 1:200 (T. gondii) e 1: 50 (N. caninum). Diluições decimais seriadas de 200 a 0,0002 µg/mL dos antígenos solúveis de T. gondii e N. caninum foram realizadas em PBS-T contendo 5% de leite desnatado para as curvas de inibição. Soros foram pré-absorvidos (v/v) durante 18 horas a 4oC com cada diluição dos antígenos inibidores. Soros incubados somente com o diluente sem inibidores foram usados como controle positivo da reação. Em seguida, as misturas soro-antígeno inibidor foram analisadas em ELISA indireto para T. gondii e N.

caninum como descrito acima. Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição,

calculada segundo a fórmula: Inibição (%) = (DO sem inibidor – DO com inibidor / DO sem inibidor) x 100 como descrito anteriormente (PUERTA et al., 2005).

3.4.4. Immunoblotting

Análises de immunoblotting foram realizadas para verificar a reatividade a antígenos imunodominantes de T. gondii e N. caninum como previamente descrito (MARCOLINO et al., 2000), com algumas modificações.

Membranas de nitrocelulose com antígenos já transferidos por eletroforese foram cortadas em tiras de aproximadamente 3 mm de largura e colocadas em canaletas apropriadas para a reação. As tiras foram bloqueadas com PBS-T contendo 5% de leite desnatado por 2 horas à temperatura ambiente e subseqüentemente incubadas por 18 horas a 4oC com amostras

de soros de cães nas diluições de 1:50 ou 1:100 em PBS-T contendo 1% de leite desnatado (PBS-TM). Após seis lavagens de 5 minutos com PBS-T, as tiras foram incubadas com os conjugados enzimáticos anti-IgG de cão-peroxidase (diluição de 1:6.000) ou proteína A- peroxidase (diluição de 1:5.000).

Soros controles positivos de cães e camundongos experimentalmente infectados com T.

gondii ou N. caninum foram também incluídos, com seus respectivos soros controles

negativos. Um anticorpo monoclonal de camundongo anti-SAG1 de T. gondii (clone 6E9) e soro de camundongo normal foram também utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente, para este marcador de superfície. Estes anticorpos foram revelados com anti- IgG de camundongo-peroxidase (diluição de 1:1.000).

Após incubação por 2 horas à temperatura ambiente e novo ciclo de lavagens como anteriormente descrito, as tiras foram reveladas pela adição do substrato enzimático que consistiu de 3,3´-tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB; Sigma Chemical Co.) a 1 mg/mL em PBS e H2O2 a 1% ou com tabletes comerciais (Sigma Fast DAB, Sigma Chemical

Co.). A reação foi interrompida com água destilada quando bandas de coloração marrom foram visualizadas. As massas moleculares aparentes das bandas antigênicas foram estimadas a partir dos cálculos da mobilidade relativa (Rf), segundo a curva do padrão de peso molecular de referência, usando o programa de análise de imagens Kodak Digital Science 1D (Kodak, EUA). Amostras de soros que apresentaram reatividade ao antígeno SAG1 (p30) de

T. gondii e a pelo menos dois de três (17, 29-32, 35-37 kDa) antígenos imunodominantes de N. caninum foram consideradas positivas por immunoblotting.

3.4.4.1 Immunoblotting de inibição

Análises de immunoblotting de inibição foram realizadas para identificar os antígenos de reatividade cruzada entre T. gondii e N. caninum reconhecidos por soros de cães, como anteriormente descrito (PUERTA et al., 2005), com algumas modificações.

Soros de cães positivos a ambos parasitos foram diluídos a 1:50 em PBS-T contendo 5% de leite desnatado e pré-incubados (v/v) com 200 µg/mL de cada antígeno inibidor (T. gondii e N. caninum) por 2 horas a 37oC. Soros incubados somente com o diluente foram usados como controle positivo da reação. Soros pré-absorvidos foram centrifugados (10.000 x g, 10 minutos, 4oC) e os sobrenadantes foram incubados com membranas de nitrocelulose contendo antígenos já transferidos de T. gondii e N. caninum, seguindo o mesmo protocolo descrito para immunoblotting. Bandas antigênicas foram analisadas com o programa de análise de imagens Kodak Digital Science 1D, calculando a intensidade de cada banda (Int Band)

expressa in pixels. A porcentagem de inibição foi calculada segundo a fórmula: Inibição (%) = (Int Band sem inibidor – Int Band sem inibidor / Int Band com inibidor) x 100.

3.4.4.2 Imunoprecipitação

Imunoprecipitação foi realizada usando antígeno de N. caninum marcado com biotina (fornecido por L.H. Kasper, Dartmouth Medical School, Hanover, NH, EUA), conforme descrito anteriormente (PEARCE; SHER, 1989), com algumas modificações.

Amostras de soros (diluição de 1:50) de cães positivos para N. caninum foram pré- incubadas com o antígeno marcado com biotina durante 18 horas a 4oC e então precipitadas com proteína A-sepharose-4B (Sigma Chemical Co.) por 2 horas a 4oC. O material imunoprecipitado foi submetido a duas lavagens com PBS (300 x g, 10 minutos, 4oC), solubilizado em tampão de amostra durante 5 minutos a 100oC e separado em SDS-PAGE a 12%. Após a separação eletroforética, os antígenos foram transferidos para membranas de nitrocelulose e a reação desenvolvida como descrito para immunoblotting. Os antígenos foram detectados usando estreptavidina-peroxidase (Sigma Chemical Co.) diluída a 1:1000 em PBS- TM e revelados com tabletes de DAB (Sigma FAST, Sigma Chemical Co.).

3.5. Detecção de parasitos

A detecção de T. gondii foi realizada em tecidos de cães experimentalmente infectados com a cepa RH através da inoculação do material em camundongos (bioensaio) e técnicas imunohistoquímicas.

3.5.1 Bioensaio em camundongos

Amostras de tecidos (baço, pulmão, cérebro, coração, rim, músculo esquelético, olho e língua) foram coletadas, homogeneizadas separadamente em meio RPMI 1640 suplementado com penicilina G (100 U/mL) e estreptomicina (100 µg/mL) e inoculadas por via intraperitoneal (volume de 0,5 mL) em cinco camundongos para cada tecido, como anteriormente descrito (JACOBS; REMINGTON; MELTON, 1960). Camundongos foram observados diariamente e esfregaços dos exsudatos peritoneais dos animais que morreram foram examinados em microscopia óptica para a presença de taquizoítas livres. Camundongos sobreviventes foram examinados 15 e 30 dias após a infecção para análise da soroconversão por ELISA indireto, como acima descrito, usando anti-IgG de camundongo-peroxidase (Sigma Chemical Co.).

3.5.2 Imunohistoquímica

Amostras de tecidos foram fixadas em 10% de formalina tamponada com fosfatos 10 mM (pH 7,2) durante 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, o material foi rotineiramente incluído em parafina e cortes de 3 µm de espessura foram obtidos e colhidos em lâminas microscópicas de vidro. Após os processos de desparafinização (xilol) e hidratação (concentrações decrescentes de álcool) convencionais, os cortes foram incubados com ácido acético a 5% para bloqueio da fosfatase alcalina endógena por 10 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem com solução salina tamponada com Tris 50 mM (TBS, pH 7,4) por 5 minutos, o material foi incubado com soro normal de cabra a 2,5% por 1 hora a 37oC para bloqueio de sítios não-específicos. Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpo primário (soro de coelho anti-T. gondii) diluído 1:100 em TBS por 18 horas a 4oC. Em paralelo, cortes foram incubados com soro de coelho normal (controle negativo da reação). Após duas lavagens por 5 minutos em TBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário (IgG de cabra anti-IgG coelho marcada com biotina) diluído a 1:250 em TBS por 1 hora a 37oC.

Após novas lavagens como anteriormente descrito, a reação foi amplificada pela incubação com o complexo estreptavidina-fosfatase alcalina-biotina (Dako A/S, Dinamarca) diluído a 1:200 em TBS por 30 minutos a 37oC. A revelação foi realizada com o substrato Fast Red/Naphthol (Sigma Chemical Co.) e a contracoloração foi feita com hematoxilina de Meyer por 10 minutos. Após secagem ao ar, as lâminas foram montadas com glicerina e lamínula, e o material examinado em microscopia óptica comum (aumento de 200X).

3.6 Análise estatística

A análise estatística consistiu na utilização de programas computadorizados (Statistic for

Windows – versão 4.5 A - Statesoft, Inc. 1993; GraphPad Prism versão 3.0 – GraphPad Software, Inc) para cálculos de freqüência, média, desvio padrão, correlações e associações.

Testes paramétricos foram empregados quando os dados apresentaram distribuição normal ou Gaussiana. Caso contrário, os dados foram analisados por testes não-paramétricos. Todos os resultados foram considerados significativos para um nível de significância de p < 0,05.

Porcentagens de soropositividade para T. gondii e N. caninum foram analisadas em diferentes grupos pelo método do qui-quadrado (estudos IV e V).

Médias geométricas com intervalos de confiança de 95% foram determinadas para os níveis de anticorpos expressos em índice ELISA e diferenças entre médias foram analisadas

pelo teste t de Student (estudo II) ou por ANOVA usando o teste de comparação múltipla de Tukey (estudo V).

A correlação entre os anticorpos de captura anti-IgM humana e anti-IgM canina em McELISA (estudo II) e entre os níveis de anticorpos obtidos pelos diferentes conjugados enzimáticos (estudo V) foi calculada pelo teste de correlação de Pearson.

Para determinar os títulos ótimos de cut off em IFAT e ELISA para T. gondii (estudo I) e N. caninum (estudo IV), os parâmetros de sensibilidade e especificidade dos testes foram avaliados considerando a reatividade aos antígenos imunodominantes de cada parasito em

immunoblotting, que foi usado como teste de referência. Desta forma, a sensibilidade e

especificidade foram determinadas em diferentes títulos de cut off para cada teste usando a curva TG-ROC (two-graph receiver-operating characteristic) como anteriormente proposto (GREINER; SOHR; GÖBEL, 1995).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Devido à ausência de dados da infecção por T. gondii na população canina de Uberlândia, MG até 1994, nós inicialmente determinamos a freqüência de anticorpos anti-T.

gondii em cães amostrados durante a campanha de vacinação anti-rábica canina realizada pelo

Centro de Controle de Zoonoses de Uberlândia (CABRAL et al., 1998a). Analisando 218 amostras de soros por IHAT e considerando títulos ≥ 64 como positivos, a freqüência de anticorpos anti-T. gondii foi 52,7% em cães da área urbana, com títulos de anticorpos mais freqüentes entre 128 e 512. Foi observada uma soropositividade significativamente maior (59,6%) para cães mestiços (sem raça definida) quando comparado aos cães com raça definida (33,3%). Estes resultados podem refletir a influência de diferentes condições de manejo as quais os animais poderiam estar sendo submetidos, particularmente relacionados ao tipo de alimentação e cuidados sanitários, do que propriamente à predisposição genética. Um aumento significativo na soropositividade foi observado com o avançar da idade (38,9% para cães de 0-2 anos e 78,5% para animais com mais de 10 anos), indicando um crescente risco de exposição pós-natal ao parasito com o tempo. Vários inquéritos soroepidemiológicos mais recentes têm consistentemente confirmado estes achados (BRITO et al., 2002; ALI et al., 2003; CAÑÓN-FRANCO et al., 2004a; AZEVEDO et al., 2005; ASLANTAS et al., 2005).

Em seqüência, um novo inquérito soroepidemiológico (CABRAL et al., 1998b) foi realizado em cães da área rural do município de Uberlândia, MG, sendo amostrados 327 cães em postos móveis de vacinação anti-rábica canina realizada pelo Centro de Controle de Zoonoses de Uberlândia, em 1995. Amostras de sangue foram obtidas através de eluatos sanguíneos em papel de filtro e analisadas por IFAT, com triagem sorológica nas diluições de 1:20 e 1:40. A freqüência da infecção por T. gondii na população canina da área rural foi 55%, com títulos mais freqüentes entre 20 e 40 (74% das amostras), sugerindo um provável caráter crônico da infecção nesta população canina rural.

Vários estudos têm sido realizados sobre a prevalência de anticorpos anti-T. gondii em cães. Entretanto, a maioria deles não tem estabelecido um estudo comparativo entre os diversos testes sorológicos e sua possível relação com a infecção ativa por T. gondii. Assim, em nosso estudo prévio (SILVA et al., 1997), uma comparação foi realizada entre os títulos de anticorpos obtidos em três testes sorológicos (IHAT, IFAT e ELISA) conduzidos com 40 amostras de soros de cães com sinais clínicos sugestivos de toxoplasmose. Títulos ≥ 64 foram considerados positivos para todos os testes. Os resultados mostraram que, embora todas as

amostras fossem oriundas de cães com sinais clínicos compatíveis com toxoplasmose, 57% foram negativas em todos os testes e 43% foram positivas em pelo menos um teste. A alta porcentagem de animais soronegativos reflete a variedade e sobreposição de sinais clínicos não específicos entre toxoplasmose e outras doenças infecciosas, e portanto, um resultado sorológico negativo para T. gondii torna-se importante para o clínico na busca de outros diagnósticos. Dos animais soropositivos, foi possível identificar dois grupos distintos: (1) 20% de amostras positivas em todos três testes com altos títulos de anticorpos, variando de 128 a 8192; e (2) 23% de amostras positivas em somente um ou dois testes, principalmente IFAT e ELISA, com baixos títulos de anticorpos, variando de 64 a 128. Além disso, as amostras IgM reativas detectadas por IHAT usando 2-ME e por M-Toxo (teste de IHAT modificado por Yamamoto; Shimizu; Camargo, 1991) estavam predominantemente incluídas no primeiro grupo (soros positivos em todos três testes com altos títulos de anticorpos), sugerindo que estes animais poderiam estar apresentando infecção ativa. Por outro lado, amostras do segundo grupo (soros positivos em um ou dois testes com baixos títulos de anticorpos) poderiam pertencer a animais com infecção crônica. Domingues e colaboradores (1998) também realizaram uma avaliação comparativa entre IFAT e ELISA para o sorodiagnóstico da toxoplasmose canina, mostrando maior sensibilidade do ELISA indireto (62,5% de amostras soropositivas) comparado ao IFAT (46% de amostras soropositivas), inclusive na detecção de casos clínicos de toxoplasmose aguda.

Os resultados deste estudo (SILVA et al., 1997) permitiram concluir que dos testes sorológicos utilizados, IFAT e ELISA foram os métodos mais indicados enquanto IHAT foi o menos sensível e, portanto, um resultado negativo por IHAT deve ser cuidadosamente interpretado, já que a possibilidade da infecção por T. gondii não pode ser excluída. Assim, o diagnóstico da toxoplasmose em cães deve ser baseado em uma combinação de testes sorológicos, particularmente IFAT e ELISA, com ênfase na determinação dos títulos e classes de anticorpos específicos.

A seguir, uma síntese dos resultados e discussão dos estudos abordados nesta tese (estudos I a V) será apresentada e, maiores detalhes, incluindo tabelas e figuras, poderão ser visualizados nos respectivos artigos em Apêndices.

4.1 Estudo I

Optimisation of cut-off titres in Toxoplasma gondii specific ELISA and IFAT in dog sera using immunoreactivity to SAG-1 antigen as a molecular marker of infection

Há uma grande variação nas freqüências de anticorpos anti-T. gondii em cães em todo o mundo, refletindo a diversidade de métodos sorológicos empregados, tamanho das amostras, bem como o tipo e período da população estudada. Ainda usando o mesmo teste sorológico, variações podem ocorrer devido aos diferentes valores de cut off estabelecidos e qualidade ou grau de purificação dos reagentes. Portanto, as diferenças em sensibilidade e especificidade dos diversos testes sorológicos empregados em diferentes laboratórios tornam difícil efetuar comparações entre soroprevalências de diferentes estudos.

Variações na prevalência da infecção por T. gondii em cães podem estar relacionadas a diferentes taxas reais de infecção ou a diferentes sensibilidades dos diversos testes utilizados e são estreitamente dependentes do título considerado como positivo nos testes sorológicos. Em nosso estudo prévio (SILVA et al., 1997), nós consideramos como critério de positividade para IHAT, IFAT e ELISA, o título ≥ 64, com base em estudos soroepidemiológicos da infecção por T. gondii em cães. Entretanto, os critérios adotados para amostras de soro ser consideradas positivas diferem entre os diferentes estudos e testes sorológicos empregados. Além disso, é possível o isolamento de T. gondii em camundongos inoculados com tecidos de animais com baixos títulos de anticorpos (< 16) detectados por MAT e Sabin Feldman (DUBEY et al., 1989). Além disso, baixos títulos de anticorpos anti-T. gondii podem refletir reatividade cruzada com outros parasitos Apicomplexa (GANLEY; COMSTOCK, 1980).

No estudo I, nós determinamos os títulos de cut-off ótimos para IFAT e ELISA na detecção de anticorpos anti-T. gondii em soros de cães, considerando a reatividade a SAG1 (antígeno de superfície de T. gondii) em immunoblotting como marcador molecular da infecção. A proteína SAG1 (p30) é expressa especificamente por taquizoítas de T. gondii e é considerada como antígeno imunodominante do parasito (RODRIGUEZ et al., 1985). Das 212 amostras de soros de cães analisadas por IFAT e ELISA em diluições duplas seriadas a partir de 1:16 (IFAT) e 1:32 (ELISA), 117 (55,2%) foram concordantes reativas em ambos testes, 65 (30,7%) foram concordantes não-reativas e 30 (14,1%) tiveram resultados discordantes (reatividade somente em ELISA).

A sensibilidade (Se) e especificidade (Sp) de IFAT e ELISA foram então determinadas para diferentes títulos de cut-off para cada teste usando a curva TG-ROC (GREINER; SOHR; GÖBEL, 1995) e considerando a reatividade para SAG1 (p30) de T. gondii em

immunoblotting como marcador molecular da infecção. O ponto de intersecção das duas

curvas (Se e Sp) indica o título de cut off no qual sensibilidade e especificidade se equivalem. Assim, títulos ótimos de cut-off foram obtidos para IFAT (16) e ELISA (64) (Fig. 1).

Amostras de soros concordantes reativas em ambos IFAT e ELISA sempre reconheceram o antígeno SAG1, e aquelas com baixos títulos de anticorpos (16 a 64) mostraram fraca reatividade. As amostras com maiores títulos (≥ 128) revelaram forte e consistente reatividade para SAG1 além do reconhecimento de outros antígenos (Tabela 1, Fig. 2). Soros de cães experimentalmente infectados com T. gondii também reconheceram consistentemente SAG1 enquanto soros controles negativos não reconheceram este antígeno (dados não mostrados). Nenhuma reatividade para SAG1 foi encontrada em amostras de soros concordantes não-reativas, embora algumas amostras reconheceram fracamente outros antígenos (Fig. 3), indicando uma provável reatividade cruzada com outros parasitos Apicomplexa devido a antígenos comuns, especialmente de micronemas e roptrias. Amostras com resultados discordantes incluíram soros com baixos títulos (16 a 64) que mostraram nenhuma ou fraca reatividade para SAG1, sugerindo reatividade cruzada com outros coccídeos.

A comparação entre os títulos de IFAT e a reatividade para SAG1 em immunoblotting revelou 84,4% de resultados concordantes (positivos e negativos), com apenas 5,2% de soros positivos em IFAT que não reconheceram SAG1 e, ao contrário, 10,4% de soros negativos em IFAT que mostraram fraca reatividade para SAG1. Resultados similares foram obtidos na comparação entre ELISA e immunoblotting, com 84% de resultados concordantes, somente 7,1% de soros positivos em ELISA sem reatividade para SAG1 e 8,9% de soros negativos em ELISA mostrando reatividade para SAG1.

Estes resultados permitiram concluir que a reatividade para SAG1 (p30) em

immunoblotting mostrou ser uma poderosa ferramenta para determinar os títulos ótimos de cut-off em IFAT e ELISA e reforçam a combinação de testes sorológicos com ênfase na

determinação dos títulos de anticorpos para o diagnóstico da infecção por T. gondii em cães. Além disso, os dados apontam para estudos sobre a utilização de SAG1 purificada substituindo o antígeno total de T. gondii em testes sorológicos para um diagnóstico mais acurado da toxoplasmose canina. Neste contexto, Kimbita e colaboradores (2001) relataram a utilização de SAG1 recombinante purificada em ELISA para o sorodiagnóstico da infecção por T. gondii em gatos, mostrando claramente que o teste foi capaz de diferenciar entre soros de animais experimentalmente infectados e controles.