ELISA equimiluminescência

 Kit 1: QUANTA Lite®ANA (Inova Diagnostics, San Diego, CA, EUA): ELISA que utiliza como substrato antígenos purificados do núcleo e nucléolo de células HEp-2, associados com os seguintes antígenos purificados: dsDNA, histonas, Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, centrômero, Jo-1, proteína ribossomalP, PCNA e mitocôndria. O conjugado é um anticorpo de cabra anti-IgG humana marcado com peroxidase. As amostras foram diluídas manualmente na proporção de 1:41 em solução diluente de amostras HRP e incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. As etapas seguintes do teste foram realizadas no equipamento automatizado Stat Fax® 2000, de acordo com o seguinte protocolo:cada poço da placa foi lavadotrês vezes com solução de lavagem HRP. Após a última lavagem, o conjugado foi adicionado e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente.Após a incubação o conjugado foi removido por etapa de lavagem idêntica à descrita acima, o cromógeno TMB foi adicionado e incubado por 15 minutos, em temperatura ambiente. Por fim, a solução de paragem HRP foi adicionadaàs placas e incubada por 5 minutosà temperatura ambiente e a densidade óptica (DO) de cada amostra determinada no comprimento de onda de 450 nm. A reatividade de cada amostra foi calculada dividindo-se a DO da amostra pela DO do controle positivo baixo e

37 multiplicando-se o valor obtido pelo número de unidades que se encontra no rótulo do controle positivo baixo. Foram consideradas positivas as amostras com resultado igual ou superior a 20 U (unidades). Todas as corridas foram validadas pelo controle positivo e negativo fornecidos pelo fabricante.

 Kit 2: ORGENTEC ANA Detect (ORGENTEC Diagnostica, Mainz, Alemanha): ELISA que utiliza como substrato os antígenos purificados SSA 52/Ro 52, SSA 60/Ro 60, SSB/La, RNP/Sm, RNP-70, RNP-A, RNP-C, SmB‟, Sm-D, Sm-E, Sm-F, Sm-G, Scl- 70, Jo-1, dsDNA, ssDNA, poli-nucleossomos, mononucleossomos,complexo de histonas, histona H1, histona H2A, histona H2B, histona H3, histona H4, PM-/Scl-100 e CENP-B. O conjugado é um anticorpo anti-IgG humana marcado com peroxidase. As amostras dos pacientes foram diluídas manualmente na proporção de 1:100 em solução diluente de amostras e incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos. As etapas seguintes do teste foram realizadas no equipamento automatizado Stat Fax® 2000, de acordo com o seguinte protocolo: cada poço da placa foi lavado três vezes com solução de lavagem. Após a última lavagem, o conjugado foi adicionado às placas e incubado por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação o conjugado foi removido por etapa de lavagem idêntica à descrita acima, o substratoTMB foi adicionado e incubado por 30 minutos em câmara escura, à temperatura ambiente. Por fim, a solução de paragem foi adicionada e incubada por 30 minutos em câmara escura, à temperatura ambiente e a DO de cada amostra determinada no comprimento de onda de 450 nm. As amostras com índice menor que 1,0 foram consideradas negativas, entre 1,1 e 1,2 indeterminadas e acima de 1,2 positivas. Todas as corridas foram validadas pelos controles positivo e negativo fornecidos pelo fabricante.

 Kit 3: IMTEC ANA Screen (HUMAN Diagnostics Worldwide, Magdeburg, Alemanha): ELISA que utiliza como substrato o núcleo íntegro de células HeLa ligado covalentemente à placa de poliestireno. O conjugado é um anticorpo anti-IgG, IgA e IgM humanas marcado com peroxidase. As amostras dos pacientes foram diluídas manualmente na proporção de 1:100 em solução diluente de amostras e incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. As etapas seguintes do teste foram realizadas no

38 equipamento automatizado Stat Fax® 2000, de acordo com o seguinte protocolo: cada poço da placa foi lavado três vezes com o tampão de lavagem. Após a última lavagem, o conjugado foi adicionado e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação o conjugado foi removido por etapa de lavagem idêntica à descrita acima, o substrato TMB adicionado às placas e incubado por 10 minutos em câmara escura, à temperatura ambiente. Por fim, a solução de paragem foi adicionada e a absorbância de cada amostra determinada no comprimento de onda de 450 nm. A reatividade de cada amostra foi calculada pela interpolação do valor da absorbância da amostra na curva de calibração. Amostras com resultado abaixo de 40U/mL foram consideradas negativas, entre 40 a 50 U/mL indeterminadas, e acima de 50 U/mL positivas. Todas as corridas foram validadas pelos controles positivo e negativo fornecidos pelo fabricante.

 Kit 4: LIAISON ANA Screen (DiaSorin, Saluggia, Itália): ensaio por quimiluminescência indireta que utiliza como substrato antígenos purificados do núcleo de células HEp-2, associados com os seguintes antígenos recombinantes ou purificados: Sm/RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, CENP-B, PDC, dsDNA na forma de oligonucleotídios sintéticos, imobilizados em partículas magnéticas. O conjugado é um anticorpo monoclonal de rato anti-IgG humana marcado com isoluminol. Todas as etapas de aspiração e diluição das amostras, de dispensação do conjugado, do substrato e dos agentes iniciadores, e de incubação e de lavagem, foram realizadas no analisador LIAISON (DiaSorin, Saluggia, Itália). Resultados com índice abaixo de 1,5 foram considerados negativos, e com índice igual ou superior a 1,5 foram considerados positivos. Todas as corridas foram validadas pelos controles positivo e negativo fornecidos pelo fabricante.

A composição antigênica dos substratos de cada kit e as suas principais características metodológicas estão descritas nos quadros 2 e 3.

39

Quadro 2: Composição antigênica dos testes ELISA e quimiluminescência

Antígeno Kit 1 Kit 2 Kit 3 Kit 4

Extrato HEp-2 Sim Não Não Sim

Extrato nucléolo Sim Não Não Não

Núcleo HeLa Não Não Sim Não

dsDNA Sim* Sim Não Sim§

ssDNA Não Sim Não Não

Nucleossomo Sim Sim Não Não

Histonas Sim* Sim Não Não

SSA/Ro 52 kD Não Sim Não Não

SSA/Ro 60 kD Sim Sim Não Sim

SSB/La Sim Sim Não Sim§§

Sm/RNP Sim Sim Não Sim

Jo-1 Sim Sim Não Sim§§

Scl-70 Sim Sim Não Sim§§

CENP B Sim Sim Não Sim§§

Ribossomal P Sim Não Não Não

Mitocôndria Sim Não Não Sim§§

PM/Scl Sim Sim Não Não

PCNA Sim Não Não Não

*Sob a forma de complexo DNA/histona (nucleossomo)

40

Quadro 3: Características dos testes ELISA e quimiluminescência

HRP: peroxidase de rábano NA: não se aplica

* soro e conjugado, em minutos

** resultados calculados como índice (divisão da DO da amostra pelaDO do controle positivo baixo) RI: faixa de resultados indeterminados