Elucidação estrutural de CC1

A substância CC1 foi caracterizada previamente ao isolamento como sendo um flavonoide pelo desenvolvimento de fluorescência quando cloreto de alumínio é empregado como revelador em cromatografia em camada delgada, e pelo espectro de absorção no

ultravioleta com duas bandas características de flavonoides obtido durante análise dos extratos e frações por CLAE (itens 5.1.1 e 5.1.2.2)

Análise de CC1 por CCD de sílica gel (item 4.2.3), indicou valor de Rf igual a 0,46, pouco maior que aquele observado para a rutina (0,37), sugerindo tratar-se de flavonoide ligado a grupo polar. Além disso, sua decomposição durante o processo de isolamento levou a formação de flavonoide com Rf igual ao da quercetina. A fim de elucidar a estrutura química de CC1 procedeu-se sua análise por espectrofotometria no ultravioleta (UV) com uso de reativos, infravermelho (IV) e por RMN de 1_{H e de} 13_C.

A análise dos espectros no UV-Vis obtidos com o uso de reagentes de deslocamento permitiu chegar às conclusões resumidas na Tabela 31 e detalhadas no texto a seguir.

Tabela 31: Resultados da análise do espectro de absorção no UV para CC1. Reagentes e

solventes

λ max (valores em nm)

Conclusão Banda II Banda I

MeOH 256 352 Flavonol ou flavonol substituído em C-3

MeOH + NaOMe 272 404 Hidroxilas livres em ambos os anéis,

ausência de hidroxila livre em C-3, hidroxilas livres em C-4’

MeOH + NaOAc 273 407 Hidroxilas livres em C-4’ e C-7

MeOH + NaOAc + H3BO3

263 380 Grupo orto-diidroxi no anel B

MeOH + AlCl3 275 425 Hidroxilas e/ou carbonilas que

complexam com Al+3 _{em ambos os}

anéis

MeOH + AlCl3 + HCl 275 384 Hidroxila na posição 5 e grupo orto-

diidroxi no anel B

O espectro de absorção no ultravioleta registrado para CC1, em metanol, apresentou λmax em 256 (banda II) e ombro em 352 nm (banda I), compatível com flavonol (352 e 285

nm) ou flavonol substituído em C-3 (328 e 357 nm), provavelmente com grupo sulfato que fornece máximo de absorção em comprimento de onda em torno de 250 nm, ou grupo metila, com máximo de absorção em 258 nm (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; BARRON et al., 1988). A comparação do espectro de CC1 com aquele da quercetina (máximo para a banda I em λ = 370 nm) indica deslocamento hipsocrômico da banda I devido à substituição em C-3.

Após adição de acetato de sódio também se observou deslocamento batocrômico em ambas as bandas (λ = 272 e 404 nm), demonstrando a presença de hidroxilas nos anéis A e B. O espectro de flavonas e flavonóis em presença de metóxido de sódio fornece

informações sobre o padrão de hidroxilação, pois, como se trata de base forte, tal reagente tem a capacidade de ionizar todos os grupos hidroxila presentes, resultando em efeito batocrômico pela presença par de elétron adicional em ressonância após a adição da base. Um deslocamento batocrômico da banda I de cerca de 40 a 65 nm sem diminuição da sua intensidade, como o observado para a substância em questão, indica hidroxila livre no carbono 4’. O fato deste espectro permanecer estável por 5 min indica ausência de hidroxila livre em C-3 (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970). Quanto à banda I, conforme discutido acima, provavelmente não há presença de hidroxila livre em C-3; portanto, o deslocamento observado foi atribuído à presença de hidroxila livre em C-4’.

A adição de ácido bórico em presença de acetato de sódio produziu deslocamento batocrômico na banda I (λ = 380 nm) em relação ao espectro obtido em metanol (λ = 352 nm), indicando formação de complexo com grupos orto-diidroxi. Deslocamento batocrômico de 12 a 30 nm na banda I indica presença de grupo orto-diidroxi no anel B (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; BARRON et al., 1988).

Adição de cloreto de alumínio resultou em deslocamento batocrômico tanto na banda I quanto na banda II, indicando a formação de complexo estável com hidroxilas em C-3 ou C-5, ou formação de complexo lábil com sistemas orto-diidroxi em ambos os anéis. Adição de ácido clorídrico à solução contendo cloreto de alumínio não produziu alterações na banda II, demonstrando a presença de grupos hidroxila em C-3 ou C-5, que formam complexos ácidos estáveis com cloreto de alumínio e carbonila, e deslocamento hipsocrômico da banda I (λ = 384 nm), confirmando presença de grupo orto-diidroxi não estável no anel B. Em relação ao espectro em metanol, ainda há deslocamento, o que indica existência hidroxila nas posições 3 e/ou 5. Conforme discutido acima, provavelmente não há hidroxila livre em C-3 e, portanto, o deslocamento observado foi atribuído à presença de hidroxila livre em C-5 (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; BARRON et al., 1988). A existência de sistema orto- diidroxi no anel B de flavonol é reforçada pela presença no espectro de ombro ou de dois picos de absorção entre 250 e 275, os quais são observados em flavonoides oxigenados nos carbonos 3’ e 4’ ou 3’, 4’ e 5’ (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970; BARRON et al., 1988). No caso de CC1 observa-se ombro.

Concluindo, a análise dos espectros de absorção no ultravioleta, empregando-se reagentes de deslocamento, indica ser a quercetina a aglicona de CC1 (49), com O- substituinte na posição 3.

O O H OH O OR OH OH 49

O espectro de absorção no infravermelho de CC1 indicou a presença de grupo sulfato, apresentando bandas intensas em 1200 cm-1 _{e 1040 cm}-1_{. Tais bandas foram}

atribuídas a estiramento S=O, e ao estiramento C-O-S (BARRON et al., 1988).

A posição do grupo sulfato pode ser deduzida a partir do espectro de absorção no ultravioleta, pela adição de reativos de deslocamento. Em geral, flavonoides sulfatados exibem as mesmas características espectrais dos flavonoides metilados correspondentes; porém, sulfatação nas posições 3 ou 4’ induz deslocamento hipsocrômico mais acentuado na banda I, devido ao efeito retirador de elétrons do grupo sulfato (BARRON; COLEBROOK; IBRAHIM, 1986). Este efeito foi observado no espectro de CC1, já que absorção máxima da banda I situa-se em λ = 350 nm, comprimento de onda inferior ao da 3-O-metil-quercetina, que ocorre em λ = 358 nm e ao da quercetina em 370 nm (BARRON et al., 1988).

O espectro de RMN de 13_{C (100 MHz) obtido para CC1 (Figura 24) também foi}

similar ao relatado para a quercetina (AGRAWAL, 1989), exceto pelos valores de deslocamento químico atribuídos a C2, C3 e C4 (Tabela 32). Os dados obtidos no subespectro DEPT-135 (Figura 25) indicam a presença de 5 carbonos metínicos e ausência de carbonos metilênicos na molécula.

Os valores de deslocamento químico observados para C3 e carbonos vizinhos são compatíveis com a presença de grupamento sulfato nesta posição da aglicona. A introdução de grupo O-sulfato, retirador de elétrons, resulta em diminuição na densidade eletrônica dos carbonos orto e para posicionados a ele, e aumento na densidade eletrônica no carbono ligado ao grupo sulfato, resultando em deslocamento para valores mais afastados do TMS no primeiro caso, e em proteção do carbono que contém o grupo sulfato. Em flavonoides sulfatados na posição 3, o deslocamento do sinal referente ao carbono 2 é especialmente pronunciado (BARRON et al., 1988). Além disso, o espectro obtido para CC1 é semelhante àquele relatado por Barron, Colebrook e Ibrahim (1986) para quercetina-3-sulfato (Tabela

Figura 24: Espectro RMN de 13

Figura 25: Subespectro DEPT-135 obtido para CC1 (100 MHz, DMSO-d6).

Tabela 32: Dados do espectro de RMN de 13

C obtido para CC1 e valores da literatura para quercetina e quercetina-3-sulfato.

C CC1 a Quercetina b Quercetina-3-sulfato c 2 156,52 147,5 156,6 3 132,71 136,5 132,3 4 178,1 176,5 177,7 5 161,71 161,0 161,3 6 98,87 99,5 98,4 7 164,47 166,0 163,9 8 93,76 94,5 93,3 9 156,98 156,7 156,1 10 104,47 104,0 104,1 1’ 122,03 123,0 121,6 2’ 115,57 116,0 115,1 3’ 145,15 145,7 144,7 4’ 148,82 148,1 148,3 5’ 116,36 116,5 115,9 6’ 121,03 121,0 121,6

a. Dados obtidos no presente trabalho, 100 MHz, DMSO-d6. b. Dados relatados por Agrawal (1989), DMSO-d6.

c. Dados relatados por Barron, Colebrook e Ibrahim (1986), 100 MHz, DMSO-d6.

O espectro de RMN de 1

sinais com valores de deslocamento químico característicos de hidrogênios aromáticos (δ 6,0 a 9,5 ppm), além de sinal largo em δ 12,8 ppm atribuído a grupos hidroxila. Dois dupletos com deslocamento químico de 7,62 e 6,81 ppm, e constante de acoplamento escalar de 7,6 Hz foram atribuídos aos hidrogênios aromáticos orto posicionados H-6’ e H-5’ do anel B respectivamente (AGRAWAL, 1989), em função do valor da constante de acoplamento.

Os demais sinais, também localizados na região de hidrogênios aromáticos, são simpletos com deslocamentos químicos em δ 7,57; 6,38 e 6,17 ppm e foram atribuídos aos hidrogênios H-2’, H-8 e H-6, respectivamente (Tabela 33). O sinal em 7,57 foi atribuído ao H-2’ também por este ter ambiente eletrônico semelhante ao H-6’ (7,62 ppm) sendo aquele mais protegido (MABRY; MARKHAM; THOMAS, 1970).

Os valores de deslocamento químico atribuídos para CC1 são similares àqueles relatados por Barron, Colebrook e Ibrahim (1986) para a quercetina-3-sulfato, obtida em uma mistura com patuletina-3-sulfato (Tabela 33).

O sinal em δ 2,5 ppm é referente aos hidrogênios residuais do DMSO e aquele em δ 12,6 ppm foi atribuído aos hidrogênios das hidroxilas, enquanto o sinal em cerca de δ 3,5 ppm corresponde aos hidrogênios da água contida na amostra ou absorvida do ar pelo DMSO.

Tabela 33: Dados do espectro de RMN de 1

H obtido para CC1 e valores relatados na literatura para quercetina 3-sulfato.

H CC1 (δ, ppm) a _{Quercetina-3-sulfato (δ, ppm)} b 6 6,17; s 6,16 ; d; J = 2 Hz 8 6,39; s 6,37; d; J = 2 Hz 2’ 7,57; s 7,56; s 5’ 6,81; d; J = 7,6 Hz 6,81; d; J = 8,4 Hz 6’ 7,62, d; J = 7,6 Hz 7,62 ; dd; J = 2 e 8,4 Hz a _{Dados obtidos no presente trabalho; DMSO-d6, 400 MHz.}

b _{Dados relatados por Barron, Colebrook e Ibrahim (1986); DMSO-d6; 80,13 MHz.}

A interpretação dos espectros obtidos e a comparação com dados da literatura possibilitaram identificar CC1 como sendo quercetina-3-sulfato (50). A ocorrência desse flavonoide na espécie já havia sido anteriormente descrita (FARIAS et al., 1998); porém, no presente trabalho foi realizada a identificação inequívoca dessa substância a partir dos dados espectrais disponíveis.

Considerando que (1) a quercetina-3-sulfato resultou no pico de maior área na análise por CLAE do extrato aquoso, preparação empregada popularmente; (2) que sua hidrólise resulta em quercetina, flavonoide cuja atividade vasodilatadora já foi relatada; (3) que no presente trabalho são descritos métodos de CLAE e UV para análise quantitativa de flavonoides de C. carthagenensis; (4) que os flavonoides apresentaram melhor correlação com a atividade vasodilatadora in vitro, dentre os metabólitos secundários quantificados; propõe-se o emprego de flavonoides totais como marcadores químicos para o controle de qualidade da espécie.