EmbryoGENE DNA methylation array (EDMA)

As amostras de embriões bovinos PIV e armazenados em freezer -80 °C foram submetidas à análise de metilação do DNA utilizando EmbryoGENE DNA methylation

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5.2.1 Extração do DNA genômico

A extração do DNA genômico (gDNA) foi realizada com AllPrep DNA/RNA Mini Kit (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada) com eluição das amostras em 30 μL. Para qualificar e quantificar o DNA extraído foi feita a análise de absorbância óptica com Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies Inc.) e eletroforese em de gel de 0,5% agarose à 45 volts por 2 h.

5.2.2 Digestão com enzima MseI

Todas as amostras de gDNA (2 vezes de 15 μL para cada amostra) foram submetidas a fragmentação com a enzima MseI (5’-T/TAA-3’) em solução composta por 0,5 μL de MseI, 0,5 μL de BSA (100x), 5 μL NEB buffer 4 (10x), 28 μL de água livre de DNAse/RNAse e DNA controle (spike-in) à 37°C por 16 horas seguida por incubação à 65°C por 20 minutos. O gDNA foi precipitado com 1 μg de solução linear de acrilamida (Ambion) como carregador e 5 μL de buffer acetato de sódio (3 M, pH 5,5) acrescida de 330 μL de etanol 95% por 2 horas à -80°C. A solução foi centrifugada (>10.000g/2 minutos à 4°C), o pellet foi lavado com etanol 70% por 20 minutos à -80°C e centrifugada nas mesmas condições. O pellet foi seco ao ar e ressuspendido em 5 μL de água livre de DNAse/RNAse.

5.2.3 Ligação de adaptadores aos fragmentos de gDNA

Adaptadores foram ligados aos fragmentos de gDNA digeridos pela MseI através da utilização de 0,5 μL de cada primer (MseLig 21: 5′-AGT GGG ATT CCG CAT GCT AGT-3′, MseLig 12: 5′-TAA CTA GCA TGC-3′, 100 μM) em 0,5× One-Phor-All plus Buffer (Pharmacia Biotech) e 1,5 μL água livre de DNAse/RNAse. O anealamento foi iniciado a 65°C por 20 minutos seguido por decréscimo da temperatura de 1°C/min até 15°C. Em seguida, com as amostras ainda à 15°C, foi feita a adição de 1 μL de Adenosida trifosfato (ATP - 10mM) e 1 μL de T4 DNA ligase (5U/μL) e incubação à 15°C por 16 horas.

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5.2.4 Digestão com enzimas sensíveis à metilação do DNA

Foi realizada a fragmentação do gDNA através das enzimas de restrição de FastDigest™ [HpaII (5’-C/CGG-3’), HinP1I (5’-GC/GC-3’) e AciI (5’-C/CGC-3’)]. A cada amostra foram adicionados 5 μL de FastDigest buffer (10X), 0,5 μL de HpaII (10U/μL), 0,5 μL de HinP1I e 34 μL de água livre de DNAse/RNAse. As amostras foram incubadas por 12 horas à 37°C. Em seguida, foram adicionados 0,5 μL de AciI, 5 μL de FastDigest buffer (10X) e 44,5 μL de água livre de DNAse/RNAse à cada amostra, que foram incubadas por 4 horas à 37°C. A inativação enzimática foi feita por 10 minutos à 80°C após o término da incubação.

5.2.5 Eficiência da digestão de enzimas sensíveis à metilação do DNA

Para determinar a eficiência da fragmentação com FastDigest™ foi realizada detecção por polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) dos controles (spiked-in). Resumidamente, foi preparada uma solução contendo 1,6 μL de MgCl2 (25mM), 2 μL de LightCycler FastStart (10x) DNA Master SYBR Green mix (Roche Diagnostics Canada, Laval, QC, Canada), 14,4 μL de água livre de DNAse/RNAse e 5 μL de primers (foward e reverse - 10μM) para cada uma das fragmentações enzimáticas (para sítios de HpaII, HinP1I ou AciI) (89). À esta solução foram adicionados 1 μL de água – controle negativo; ou 1 μL de amostra; ou 1 μL 1/100 spike-in diluído em 1/1000 – controle positivo. As condições utilizadas para o qPCR foram: Denaturação - 95°C por 10 minutos; Amplificação - 50 ciclos de 95°C por 5 segundos, 52°C por 5 segundos e 72°C por 20 segundos; Fusão - 1 ciclo iniciado de 94°C por 5 segundos, 72°C por 30 segundos, 94°C por 0 segundos e resfriamento 40°C por 0 segundos (alteração de temperatura de 0,2°C/segundo). A especificidade do Amplicon é utilizada para calcular a eficiência da fragmentação e é determinada pela forma da curva de fusão e a diferença de limiar de ciclo (ΔCt) entre metilados (protegidas à fragmentação com enzimas sensíveis à metilação) e não-metilatilados (desprotegidas à fragmentação com enzimas sensíveis à metilação). Caso a fragmentação não tenha sido eficiente para alguma enzima o procedimento de fragmentação para esta foi repetido.

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5.2.6 Seleção de fragmentos por ligação mediada em PCR (LMA-PCR)

A amplificação seletiva dos fragmentos foi realizada utilizando dois rounds de ligação mediada em PCR (LMA-PCR). Após a precipitação e lavagem das amostras de gDNA como descrito no item 3.2.2 e ressuspensão em 10 μL de água livre de DNAse/RNAse, o primeiro round de LMA-PCR foi realizado utilizando 0,5 μL de cada primer foward e reverse (MseLig 21 e MseLig 12), 0,5 μL de One-Phor-All plus Buffer, 3 μL de Ex-Taq™ buffer (TaKaRa), 1 μL de Ex-Taq™ enzyme (TaKaRa), 3 μL de MgCl2 (25mM), 8 μL de Desoxirribonucleotídeos fostatados (dNTPs) e 23,5 μL de água livre de DNAse/RNAse. As condições do primeiro round de LMA-PCR foram: 15 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 segundos e 72°C por 75 segundos; 34 ciclos de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 segundos e 72°C por 105 segundos; ciclo final de 94°C por 40 segundos, 57°C por 30 segundos e 72°C por 5 minutos.

Para o segundo round de LMA-PCR (essencial para a obtenção de amplicons suficientes para as etapas futuras) foram utilizadas 3 reações por amostra do produto do primeiro round de LMA-PCR. Foram adicionados à 0,75 μL de gDNA de cada amostra (3 reações) 0,75 μL de primer MseLig21, 5 μL de PCR Buffer 1 (Roche/Boehringer Mannheim, Expand Long Template), 4 μL de dNTPs (2,5mM), 0,8 μL de Expand Long Template Enzyme Mix (Roche/Boehringer Mannheim) e 38,7 μL de água livre de DNAse/RNAse. As condições do primeiro round de LMA-PCR foram: Ciclo inicial de 94°C por 60 segundos, 65°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos; 14 ciclos de 94°C por 40 segundos, 65°C por 30 segundos e 72°C por 90 segundos; 9 ciclos de 94°C por 40 segundos, 65°C por 30 segundos e 72°C por 2 minutos; ciclo final de72°C por 5 minutos. The quality and concentration of DNA were evaluated as described above. A qualidade dos amplicons foi determinada utilizando 5 μL de produto de PCR em gel de agarose 0,8%.

5.2.7 Purificação e remoção de adaptadores

O produto de LMA-PCR foi purificado utilizando o kit de purificação de PCR 28104 (Qiagen) e eluído em 43,5 μL de Buffer de eluição 1/10. Para a remoção dos

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52 adaptadores, 20 μL de cada amostra foi incubada com 5 μL de buffer 4 NEB (10X), 0,5 μL BSA (100x), 1 μL de Msel (10 U/μL) e 48 μL água livre de DNAse/RNAse à 37°C por 16 horas, seguida de 65°C por 20 minutos. As amostras foram purificadas utilizando o kit de purificação de PCR 28104 e eluídas em 43,5 μL de Buffer de eluição 1/10. Foram realizadas leituras em espectrofotômetro NanoDrop 1000 para determinar a qualidade e quantidade de gDNA das amostras.

5.2.8 Marcação do gDNA e hibridização do array

Foi realizada a marcação de 2 μg de gDNA por amostra com Cy-3 ou Cy-5 utilizando o Universal Linkage System Fluorescent gDNA labelling kit (Kreatech Biotechnology), sendo que para cada μg de gDNA foi adicionado 1 μL de buffer de marcação 10× à 85°C por 30 minutos seguida de incubação à 4°C por 3 minutos. O kit de purificação de PCR 28104 foi utilizado para remoção dos marcadores não reativos e purificação das amostras. Para validar a incorporação do corante e concentração de gDNA foram mensuradas em espectrômetro NanoDrop 1000.

A hibridização das amostras foi iniciada com a incubação do gDNA marcado com Cy-3 ou Cy-5, comparando uma réplica de blastocistos rápidos à blastocistos lentos, com 25 μL de Cot-1 DNA de bovinos (1mg/mL, Applied Genetics Laboratories), 2,6 μL de Agente de bloqueio 100x (Agilent) e 130 μL de buffer de hibridização 2 x HI-RPM (Agilent) à 95°C por 3 minutos e 37°C por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 65 μL de Agilent-CGHBlock para eliminar o ruído do background do array. Foram alocados 245 μL das amostras na lâmina de microarray e a hibridização foi realizada em forno à 65°C e 10 rpm por 40 horas. As lâminas foram lavadas de acordo com instruções do fabricante e foi feita leitura das lâminas com PowerScanner (Tecan) seguida de análise utilizando Array-Pro Analyzer 6.3 software (MediaCybernetics).

5.2.9 Validação dos resultados do Embryogene

Foram coletados 10 embriões por grupo em 4 replicatas técnicas. Estes embriões foram submetidos à 3 ciclos de congelamento/descongelamento seguida de incubação

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53 com proteinase K (200 µg/mL). As amostras foram divididas em 3 grupos (10 µL em cada): Controle—DNA fragmentado apenas com a enzima MseI; HpaII—DNA fragmentado com as enzimas MseI e HpaII, e HinP1I—DNA fragmentado com as enzimas MseI e HinP1I (FastDigest-TermoFisher Scientifc™, USA). A fragmentação foi feita por 16 horas à 37°C, seguida de incubação por 10 minutos à 80°C seguido de resfriamento à 4°C. O gDNA foi lavado em etanol 70%, seco ao ar, e ressuspendido em 50 µL de água livre de DNAse/RNAse. Foi feita a amplificação do gDNA em RT-qPCR com primers (Tabela 9) desenhados especificamente para regiões que foram previamente identificadas como diferencialmente metiladas e que o amplicon continha apenas uma região de fragmentação para HpaII ou HinP1I e sem região para MseI. A reação de amplificação foi feita utilizando 20 µL de volume total, sendo composto de 1 µL de amostra, 1 µL do primer forward, 1 µL do primer reverse, 7 µL de água livre de DNAse/RNAse e 10 µL de Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix no Rotor-Gene Q da Qiagen.

Tabela 9: Primers desenhados para a validação do EmbryoGENE DNA methylation array.

DMR Primer Forward Primer Reverse Amplicon

Length

edma_met_11_10337 gcacgactcccttctagaca ggcagaggatctacagcca 84 edma_met_03_16369 cacatgtagaactggccca ttctcctctacgaccctaggta 91 edma_met_20_08418 ttctcctctacgaccctaggta gaagttgccccgttacttct 97 edma_met_13_05328 gaagttgccccgttacttct ctgacgttccaggagacc 83 edma_met_02_07813 ccataatgacacacactccgtt aggctctatgggacagca 87 edma_met_10_01759 aggctctatgggacagca gtcttctggaagcacctcc 84 edma_met_21_11309 gtcttctggaagcacctcc ccagaggagctgtagatcct 113