Enquadramento teórico

Notre modélisation des complexes enzyme-substrat, enzyme-état de transition et enzyme-

intermédiaire métastable suggère une déformation de la structure du substrat durant la réac­

tion. Dans la réaction catalysée par la barnase, la contrainte structurale apparaît principale­

ment localisée autour de l’angle de torsion E(o) qui adopte une conformation énergétiquement

défavorable à l’état de transition. La forte interaction électrostatique du phosphate (-1-1)

avec le site actif, en particulier les ponts H avec les Arg 83 et 87, et le nombre de ponts H entre

la guanine et le reverse tum pourrait stabiliser la déformation de la structure du ribose-phos­

phate durant la catalyse. En outre, les ponts H entre l’02’ du ribose (0) et les Arg 83 et Tyr 103

lorsque la structure du ribose-phosphate est proche de l’état de transition, sont de nature à

fragiliser la liaison 02’—H02’ dont le clivage est la première étape de la catalyse. Nos résultats

suggèrent aussi que les réarrangements structuraux nécessaires pour convertir la structure du

nucléotide dans le modèle du complexe enzyme-substrat vers celle de l’intermédiaire métas­

table n’a que peu d’impact sur les interactions entre l’enzyme et la partie du nucléotide au-

delà du phosphate (+1). En outre, la position du phosphate (+2) dans nos modèles indique

qu’il pourrait jouer un rôle important dans la catalyse puisqu’il interagit avec l’Arg 83 qui elle—

même interagit déjà avec le phosphate (+1) dans le site actif. Il est donc en bonne position

pour influencer la position et l’orientation des atomes participant à la catalyse.

Une autre conséquence de la position des phosphates (-1-1) et (-1-2) est la réduction considéra­

ble de l’espace conformationnel accessible à l’adénine (+1). Sa position, en interaction avec

l’His 102, apparaît de toute évidence la plus stabilisante avec la conséquence de contraindre

l’orientation correcte du cycle imidazole vis—à—vis de la liaison P—05’ tout en excluant la

quasi totalité de sa surface accessible du solvant (La présence du pentaribonucléotide dans le

complexe [ES]^" réduit la surface accessible au solvant de la chaîne latérale de l’His 102 de

61 à 6Â^).

Notre modélisation achevée, les coordonnées atomiques des complexes cristallins barna-

se-d(CGAC) et barnase-3’GMP furent publiées. Malgré les incertitudes inhérentes à

notre méthodologie, un bon accord est observé entre les ponts H intermoléculaires prédits

dans notre modèle (Table 14) et ceux déterminés dans le complexe

barna-se - d(CGAC) (Table 15) caractérisé par un angle de torsion glycosidique antî{\A5 ° ) de la gua-

nosine. Ceci n’est pas surprenant puisque notre modélisation est fondée sur l’hypothèse que

l’interaction entre la barnase et la guanine est semblable à celle observée dans les autres com­

plexes RNase-nucléotide et en particulier dans le complexe binase—3’GMP que nous avons

utilisé pour positionner notre guanine. La superposition des atomes lourds des chaînes princi­

pales des complexes modélisés et des complexes expérimentaux (Table 16) confirme que, quel­

le que soit la structure considérée, la chaîne principale de la barnase ne subit pas de change­

ments conformationnels importants en interagissant avec le substrat. Des observations

similaires peuvent êtres faites pour la conformation des chaînes latérales à l’exception des

Lys 27 et Arg 59 (voir ci—dessous).

Table 15. Liste des ponts H barnase-nucléotide dans les complexes cristallins

Distance (Â) 3’GMP d(GpC) d(CGAC)

O1P(0) ^{- Lys 27 .HÇ1} 1.8

O4’(o) -Tyr 103 .Ht) 3.0

O2’(o) -Tyr 103 .Hri 2.6

H02’(o) -Glu 73 .Oe2 2.6

03’(0) ^{- Lys 27 ..HÇ3 2.5}

H1(o) -Glu 60 .Oel 1.8 1.8

H22(o) -Glu 60 .Oe2 2.1 2.1

06(0) - Asn 58 .H 2.7 2.6

06(0) - Arg 59 .H 2.0 1.8

N7(o) - Ser 57 .H 2.0 2.1

01P(+i) - Lys 27 .HÇ3 2.0

01P(+i) -Arg 83 .Ht)12 2.0

01P(+i) -Arg 83 .Ht)22 2.3

01P(+i) - His 102 .He2 1.9

02P(+i) - Lys 27 .H^3 2.4

02P(+i) -Arg 83 .Ht)12 1.8

02P(+i) -Arg 83 .Ht)22 2.2

02P(+i) -Arg 87 .He 1.9

02P(+i) -Arg 87 .Ht)21 2.4

02P(+i) - Tyr 103 .Ht) 1.8

03P(+i) -Arg 87 .He 2.0

03P(+i) - Tyr 103 .Hî) 1.8

05’(+i) •-Arg 87 .Ht)21 2.3

05'(+i) •- His 102 .He2 1.4 1.8

04’(+i) -Arg 87 .Ht)21 2.9

04’(+i) -Arg 87 .Ht]22 2.6 2.8

04’(+i) - His 102 .He2 2.8 2.6

N7(+i) ■- Ser 85 _•Hy 1.9

01P(+2) •-Arg 83 .Ht)11 2.4 1.8

02P(+2) •-Arg 83 .H 2.0 2.0

Les ponts H cités sont obtenus après l’addition des atomes d’hydrogène et une minimisation

d’énergie identique à celle appliquée aux modèles. Les critères d’assignation des ponts H

sont décrits dans la légende de la Table 14.

Table 16. R.m.s.d. de la superposition des atonies lourds de la chaîne principale des modè­

les et des complexes cristallins.

Distance (Â) [ESjanf' _{[ES] SV" [El] 3’GMP d(GpC)}

[ES^y" 0.5

[El] 0.5 0.3

3’GMP 0.9 1.0 0.9

d(GpC) 0.9 1.0 0.6 0.5

d(CGAC) 0.9 0.9 0.9 0.4 0.4

La comparaison de la localisation des phosphates (-1-1) et (+2) suggère que la position du

phosphate (+2) soit plus contrainte que celle du phosphate (-1-1) (Table 17). Cette hypothèse

est conforme au résultat de la superposition des complexes barnase—d(CGAC)/barna-

se—d(GpC) qui indique une position quasi identique du phosphore (-4-2) par rapport à l’enzy­

me malgré que la direction 3’—k5’ de la chaîne nucléique soit inversée dans le complexe barna­

se—d(GpC).

Plus surprenante, est l’observation d’une interaction comparable de l’adénine (H-l) avec

l’His 102, y compris dans le complexe barnase—d(GpC) où c’est la guanine qui occupe cette

position. Ceci conforte l’hypothèse d’une interaction entre l’His 102 et la base (-4-1) avec la

conséquence d’orienter correctement le cycle imidazole vers la liaison P - 05’ pour poursuivre

la catalyse.

Table 17. Distance entre les phosphores (-1-1) et (-1-2) après superposition des atomes

lourds de la chaîne principale des modèles et des complexes cristallins.

W)— ^{\ËS\^' [ES]S7" [El] 3’GMP d(GpC)}

[ES]^yn 2.1 /1.3

[El] 1.4 / 1.6 1.0/0.6

3’GMP 0.9/- 1.7/-

0.71-d(GpC) -/1.3 - /O.O -/0.9

-/-d(CGAC) 0.7/1.3 1.7/0.1 0.8 / 0.5 0.5/ - -/0.1

Le premier chiffre correspond à la distance entre les phosphores (H-l) après superposition,

le second correspond au phosphore (-1-2). Compte tenu de l’orientation inversée du nucléoti­

de dans le complexe d(GpC) le phosphore (-fl) est assimilé phosphore (-f2).

La Figure 16 montre la comparaison structurale des complexes d(CGAC) et [ES]""'*. Il appa­

raît clairement que notre modélisation a prédit avec succès le mouvement de la chaîne latérale

de la Lys 27 en dehors du site actif où elle interagit simultanément avec les phospha­

tes (0) et (+1). Cependant, en absence d’arguments expérimentaux pour soutenir l’hypothèse

d’une conversion syn±^nti pour la guanosine d’un substrat polynucléotidique en interaction

avec la barnase, l’interprétation fonctionnelle de la réorientation de la Lys 27 demeure incer­

taine.

Figure 16. Comparaison de la conformation du nucléotide dans les complexes barna-

se-d(CGAC) et [ES]««"'.

La superposition nucléotide est obtenue par l’application de la matrice de rotation/translation

qui superpose les atomes lourds de la chaîne principale des deux enzymes. La densité électro­

nique de la cytidine 5’ terminale du complexe barnase—d(CGAC) n’étant pas interprétable,

elle n’est représentée. Le complexe barnase—d(CGAC) est illustré en traits fins et le complexe

ES]""" en traits épais.

La différence la plus importante entre ces deux structures apparaît dans la position de la

base (+2) vis-à-vis du site actif. Dans le complexe cristallin, l’extrémité 3’ de la chaîne nu­

cléique revient au-dessus du site actif de sorte que l’adénine (+1) et la cytidine (+2) sont

orientées perpendiculairement, comme cela était déjà observé dans le complexe cristallin bar-

nase—d(GpC) (Figure 17).

Figure 17. Comparaison de la conformation du nucléotide dans les complexes

barnase-3’GMP, barnase-d(GpC) et [ES]'^”.

La superposition est obtenue comme décrit dans la légende de la Figure 16. Les complexes

barnase—3’GMP et barnase-d(GpC) sont représentés en traits fins et le complexe ES]'*>’” en

traits épais.

Buckle et al. ont émis l’hypothèse que cette conformation particulière soit influencée par

l’interaction avec un autre complexe dans la maille cristalline. En considérant l’absence de

contacts ou de ponts H entre l’enzyme et la cytidine ainsi que la quasi absence de surface acces­

sible au solvant enfouie entre la cytidine et l’enzyme (<1Â^), cette conformation n’explique

pas la plus grande stabilité (0.6 kcal/mol~^) du complexe Michælien barnase—GpApA com­

parée au complexe barnase—GpApC Dans le complexe [ES]""'' (mais aussi dans les com­

plexes [ES]^” et [El]), la conformation du nucléotide est plus étendue et la base (+2) est acco­

lée au cycle phényle de la Phe 82. Eanalyse du dimère dans la maille cristalline du complexe

bamase—3’GMP crédite la possibilité que cette chaîne latérale puisse être un site d’interac­

tion secondaire pour une base car, la guanine de la molécule A interagit avec le cycle phényle

de la Phe 82 de la molécule B dans une orientation similaire à celle des complexes modéli­

sés

Dans le cristal barnase-3’GMP, la chaîne latérale de l’Arg 59 est orientée vers le solvant en

direction d’un autre complexe dans la maille cristalline. Cette orientation contraste avec celle

observée dans le complexe barnase-d(CGAC), aussi proposée dans les trois modèles, où cet­

te chaîne latérale couvre partiellement la guanine de manière comparable à la chaîne latérale

de la Tyr 45 homologue dans la RNase Tl. Eimportance de ce recouvrement a été démontrée

par la réduction de 85% du taux de transestérification de GpUp répartis sur les deux constan­

tes kcat et Km lorsque cette Arg est mutée en Ala Cependant, l’Arg étant plus longue, plus

flexible et portant une charge nette positive, son rôle pourrait ne pas être limité à la seule ré­

duction de la surface accessible au solvant de la guanine engagée dans le site de reconnaissance

comme cela est observé pour la Tyr 45 dans le RNase Tl où cette chaîne latérale semble égale­

ment venir couvrir la guanine attachée au reverse tum La conformation productive syn de

la guanosine dans les complexes [ES]^" et [El] est stabilisée par les ponts H que la chaîne laté­

rale de l’Arg 59 établit avec le phosphate (0) et le ribose (0). Nous pouvons donc en déduire

que la chaîne latérale de l’Arg 59 favoriserait l’interaction avec le conformère 5yn d’une gua­

nosine 5’OH terminale. Cette hypothèse est en accord avec les mesures expérimentales de

l’équilibre syn±ranti pour le complexe barnase-3’GMP obtenue par NMR qui montrent que

le mode d’interaction est préférentiel (69%) et est accompagné d’une réduction de la mo­

bilité du Ne de l’Arg 59

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