D1 D2 Solução extrativa desalcoolizada
4.5.3. Ensaio de atividade genotóxica dos extratos líquidos (Teste do cometa).
4.5.3.1. Cultura celular
Para este estudo, hepatoma de ratos (Rattus norvegicus), chamado de HTC (do ingles hepatoma cells), foram adquiridos do Banco de células do Rio de Janeiro, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. As células cresceram em monocamadas aderentes em tubos de cultura de 2,5 ml para o teste do cometa (Teste SCGE, abreviatura do inglês “single-cell gel electrophoresis”). As células foram cultivadas em meio de cultura D-MEM-F12 (GibcoBRL) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Gibco). O material foi cultivado a 37ºC en estufa incubadora do tipo BOD. Sob essas condições, a duração de um ciclo cellular é de 24 horas (RABELLO-GAY et al., 1991). Um número fixo de células foram distribuídas nos frascos de cultura onde cresceram por no mínimo um ciclo celular completo antes de receber os tratamentos experimentais.
4.5.3.2. Teste do Cometa
Aproximadamente 0,5x105 células de hepatoma, préviamente estabilizadas, foram distribuídas e incubadas por 24 h em tubos de cultura. As células foram tratadas com os extratos líquidos de folhas de L. ericoides EET 20 e EET 80 (produzidos com etanol 20° GL e 80° GL, respectivamente).
O agente indutor de dano utilizado foi metanosulfonato de metila (MMS), preparado na concentração final de 1,2 µM em solução tampão fosfato (PBS), livre de Ca2 e Mg2, pH 7,4, estéril. Células de hepatoma de rato HTC (fornecida pelo Laboratório de Mutagênese da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP), foram cultivadas em meio DMEN/F-12 (Gibco), suplementado com 10% de soro bovino fetal. O material foi acondicionado em estufa do tipo BOD a 37°C, por dois ciclos celulares, sendo que nessas condições o tempo de cada ciclo celular estabelecido é de 24 horas (RABELLO-GAY et al., 1991).
Após 48 horas as células foram lavadas com 5 ml de solução tampão fosfato (PBS), livre de Ca2 e Mg2, pH 7,4, estéril, para retirar resíduos e neutralizar o pH da cultura. Adicionou-se então 2,5 ml de meio fresco e as células foram submetidas aos
tratamentos com extrato líquido de L. ericoides prepadado com etanol 80 °GL, em proporção droga: solvente 1:3, com 24 horas de maceração.(EET 80), extrato líquido de L. ericoides prepadado com etanol 20 °GL, em proporção droga: solvente 1:5, com 24 horas de maceração (EET 20) e o extrato seco por nebulização, com 50% de adjuvante (ESN1), sendo que o PBS (pH 7,4) foi utilizado como controle negativo de dano e o MMS como controle positivo de dano seguindo a Tabela 6.
Após duas horas de incubação a 37°C, as células foram lavadas com 5 ml de PBS, por duas vezes. Então 2,5 ml de meio de cultura fresco foram adicionados aos frascos de cultura. O meio de cultura foi transferido para um tubo de centrífuga e as células foram lavadas novamente com PBS (5 ml) por mais duas vezes, retirando-se o excesso de tampão. A tripsina a 0,025% foi adicionada (0,3 ml) e mantido por 2 minutos para o desprendimento das células da parede do tubo e umas das outras. Em seguida a enzima foi inativada pelo mesmo meio de cultura que fora transferido para o tubo da centrífuga. A suspensão de células restante foi homogeneizada mecanicamente e centrifugada pó 5 minutos a 1500 rpm.
Tabela 6. Esquema de tratamento das células para o Teste do
Cometa.
Tratamento Quantidades adicionadas
PBS (pH 7,4) MMS 1,2 µM EET 80 25 µl 50 µl EET 20 50 µl 50 µl ESN 1 10 mg 20 mg Etanol 80 GL 25 µl 50 µl Etanol 20 GL 50 µl 50 µl Aerosil 10 mg 20 mg
O sobrenadante foi retirado até que restasse um volume aproximado de 0,5 ml. As células foram novamente homogeneizadas até suspensão completa. Esse material foi adicionado em uma lâmina previamente preparada com agarose de ponto de fusão normal, 20 µl da suspensão celular e 120 µl de agarose de baixo
ponto de fusão a 37°C. A lâmina foi coberta com lamínula e permaneceram em geladeira a 4°C por 20 minutos. Após o resfriamento do gel de agarose, as lamínulas foram retiradas e em uma cuba protegida de luz, as lâminas foram mergulhadas em solução de lise gelada, recém preparada a partir da solução estoque e mantidas em geladeira por mais 1 hora. A composição das soluções de lise pode ser observada na Tabela 7.
Tabela 7. Composição das soluções de lise utilizada no Teste do Cometa.
Solução de lise - estoque
NaCl 146,1 g EDTA titriplex 37,2 g Tris 1,2 g NaOH 8,0 g Na+Laurilsarcosinato 10,0 g Água destilada 890 ml
Solução de lise – para uso
Triton X 100 1 ml
DMSO 10 ml
Solução de lise estoque 89 ml
Após a retirada da solução de lise, as lâminas foram colocadas horizontalmente na cuba de eletroforese, lado a lado, e todas com a parte esmerilhada voltada para o pólo negativo. O material foi submetido a eletroforese, utilizando tampão de eletroforese (pH>13) gelado (30 ml de NaOH 10N, 5 ml de EDTA 200 mM e água destilada qsp 1000 ml), até a cobertura das lâminas. O sistema foi mantido a 4°C, no escuro até o final.
A fonte elétrica foi ajustada para 25V e 300 mA, sendo que após o tempo de corrida de 20 minutos, as lâminas foram cobertas com tampão de neutralização (Tris 48,5 g e água destilada qsp 1000 ml) pH 7,5, por 5 minutos, repetindo-se a operação por 3 vezes. Ao final da neutralização, as lâminas foram secas ao ar e fixadas com
etanol absoluto, por 15 minutos. A coloração foi feita com 100 µl de brometo de etídio .
A análise de cada lâmina foi realizada imediatamente após a coloração, ao aumento de 400 vezes, em microscópio de fluorescência, utilizando-se filtro de excitação de 515-560 nm e filtro de barreira de 590 nm. Em cada lâmina foram observadas 100 células não sobrepostas e distribuídas ao acaso. Após a observação as células foram classificadas conforme o comprimento da cauda de DNA migrado. Baseado no critério estabelecido por Kobayashi et al. (1995), 100 núcleos foram examinados por lâmina e classificada como a seguir: classe 0 (ausência de cauda); classe 1 (cauda com tamanho até 1 vez maior que o diâmetro do núcleo do controle negativo); classe 2 (cauda com tamanho até 2 vezes maior que o diametro do núcleo); e classe 3 (cauda maior que 2 vezes do diâmetro do núcleo). Células apoptóticas não foram contadas (SPEIT et al., 1996). Um total de 300 células foram analisadas por tratamento, e o escore médio do dano celular foi calculado pela multiplicação do número de células apresentando dano em cada classe (n) pelo valor da classe, seguindo a Equação 11:
3 ) 3 ( ) 2 ( ) 1 ( n1 n2 n3 Escore = ⋅ + ⋅ + ⋅ (11)
4.5.4. Avaliação da atividade do extrato de L. ericoides sobre o Óxido