4.2 COMPLEXOS MONONUCLEARES DE Fe(III)
4.2.3.1 Ensaio em atmosfera inerte
Experimentos de clivagem do DNA plasmidial pelo complexo C12b foi realizado em
uma glovebag inflada com Argônio, como descrito no item 3.3.6, a fim de elucidar a influência do oxigênio molecular na reação. Os resultados estão descritos na figura 48.
Figura 48 - Clivagem do DNA plasmidial pBSK-II em atmosfera de argônio. Da esquerda para a direita: controle, [Fe(EDTA)]- e complexo C12b. Condições reacionais: [DNA] = 330 ng, ~ 25 µmol.L-1; [C12b] = 30
μmol.L-1; [Tampão] = 10 mmol.L-1; Temperatura = 37 ºC; Tempo = 2h.
% D N A c li v a d o 0 Fe - ED TA C1 2 b 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A rg o n io O x ig e n io A rg ô n io O x ig ê n io
A diferença na clivagem do controle positivo [FeEDTA]/DTT (poço 2) no ensaio indica que há uma diminuição de oxigênio molecular no experimento sob atmosfera de argônio, indicando assim que o uso da glovebag permitiu uma atmosfera inerte para a realização do mesmo. Ao compararmos os dois experimentos, vemos que ocorre um pequeno
aumento da clivagem do DNA pelo complexo na presença de argônio, sugerindo que a quebra da dupla fita ocorre através de um mecanismo com caráter misto.
A ação como hidrolase de um complexo mononuclear de Fe(III) é inédito, geralmente são complexos binucleares na forma MIIMII, MIIIMII, and MIIIMIII que possuem tal
atividade, assim como alguns sistemas mononucleares de CuII (HEYING, Renata S., et al,
6. CONCLUSÕES
Os complexos em estudo foram capazes de clivar o DNA plasmidial em condições moderadas de pH e temperatura, de um modo concentração-dependente na escala milimolar e em tempos moderados de reação. Os ensaios de concentração mostram que todos os complexos que possuem alterações na segunda esfera de coordenação apresentam maior clivagem do DNA. A variação do pH também alterou a atividade dos complexos, tanto os binucleares de Fe(III)-Zn(II) quando os mononucleares de Fe(III).
Todos os complexos tiveram uma inibição da sua atividade na presença dos sais NaCl e LiClO4, indicando que a neutralização das cargas do DNA, favorecida pelos cátions,
influencia no processo de catálise. Os complexos que possuem a cadeia lateral de etilenodiamina, C12aet e C14aet são os que mostraram maior redução da atividade catalítica,
corroborando com a ideia de que a amina carregada positivamente na cadeia carbônica contribui significativamente para a estabilização da interação complexo-DNA. Isto explica como os cátions afetam o processo de catálise.
Nos ensaios com os inibidores de sulco, os complexos C12aet e C14aet demonstraram
que o efeito do verde de metila, inibidor do sulco maior, é mais significativo se comparado ao efeito da Netropsina, apesar dos complexos também sofrerem o efeito da mesma. Como o C14aet possui um pireno em sua estrutura, a sua atividade diminui ainda mais quando o verde
de metila é adicionado na reação, mostrando que esse complexo interage ainda mais com o sulco maior do DNA.
Os complexos C12aet e C14aet também interagem e alteram a estrutura secundária do
CT-DNA como observado na alteração no sinal de CD em espectroscopia de dicroísmo circular. Este experimento indicou que esses os complexos foram capazes de alterar a helicidade do DNA, bem como os empilhamentos de bases, caracterizados pela diminuição da intensidade do sinal de CD das bandas características de 275 e 245 nm do CT-DNA.
Os resultados dos ensaios com EROs indicam que os complexos clivam o DNA plasmidial com a geração de espécies do tipo R-O-OH e 1O
2, possuindo assim atividade
oxidativa frente ao DNA. Isso foi comprovado porque o iodeto de potássio e a azida de sódio são capazes de inibir consideravelmente a clivagem do DNA pelos complexos C12aet e C14aet
e também porque a adição de DMSO aos sistemas reacionais não exerceu influência na reação.
Na clivagem do DNA sob atmosfera inerte pelos complexos C12aet e C14aet, foi
verificado que ocorre uma diminuição significativa da clivagem do DNA pelos complexos na presença de argônio, sugerindo que a quebra da dupla fita ocorre através de um mecanismo com caráter oxidativo, corroborando com os resultados mostrados pelos ensaios com EROs. Já os complexos C12b e C14b mostraram um pequeno aumento da clivagem do DNA na
presença de argônio, sugerindo que a quebra da dupla fita ocorre através de um mecanismo com caráter misto. É a primeira vez que complexos mononucleares de Fe(III) mostram atividade como hidrolases sintéticas.
Os ensaios cinéticos mostraram que os complexos C12aet e C14aet possuem uma boa
atividade catalítica frente ao DNA, mas a presença dos grupos naftaleno e pireno em suas estruturas acaba causando uma inibição da atividade catalítica em relação à complexos descritos na literatura. Isso pode ser explicado devido a maior interação com o DNA com a intercalação dos grupos poliaromáticos, o que dificulta a ação enzimática do sítio ativo. Ainda com relação à esse ensaio, pode-se observar que o complexo mais ativo entre os estudados neste trabalho é o C14aet, confirmando os outros resultados obtidos anteriormente.
No caso dos complexos mononucleares de Fe(III), como eles não possuem a cadeia lateral funcionalizada, o efeito da presença do grupo naftaleno se mostrou ser mais efetivo na clivagem do DNA que o do pireno, causando um maior kobs e isso pode ser explicado devido a
força da interação π-stalking dos anéis aromáticos com a cadeia do DNA. O naftaleno é menor, sendo assim, ele consegue se intercalar mais facilmente na estrutura do DNA e ser mais fortemente atraído, aumentando a clivagem do mesmo.
Por fim, é possível afirmar que a adição de uma molécula de etilenodiamina como cadeia lateral funcionalizada teve efeito significativo na segunda esfera de coordenação destes complexos, assim como esse fato ocasionou um aumento da afinidade destes pelo DNA, indicando ser uma metodologia capaz de potencializar a atividade de interação e clivagem de DNA por complexos metálicos.
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