Ensaio do Cometa

O ensaio do cometa, também designado de eletroforese em gel de uma única célula (do inglês, single-

cell gel electrophoresis), tornou-se num dos métodos mais comuns para avaliar danos no DNA, com

aplicações em testes de genotoxicidade, biomonitorização humana e epidemiologia molecular, ecogenotoxicologia bem como, na investigação dos mecanismos moleculares de geração de danos no DNA e sua reparação. Esta metodologia, encontrando-se ainda em desenvolvimento, apresenta características vantajosas como a sua simplicidade, sensibilidade, versatilidade, velocidade e economia. É também uma das técnicas usadas na área de investigação do cancro para a avaliação da genotoxicidade (A. R. Collins 2004).

Este procedimento foi assim designado, por a imagem resultante se assemelhar a um “cometa” com cabeça e cauda distintos, onde a cabeça é composta pelo DNA intacto, enquanto que a cauda consiste nos fragmentos de DNA resultantes de danos ou quebras simples ou duplas na cadeia de DNA (Sanadi

et al. 2004). O “cometa” pode ser analisado digitalmente, extrapolando-se a extensão dos danos no DNA

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captadas por um microscópio com um software desenvolvido para este propósito (Olive and Banáth 2006).

Tecnicamente, este método envolve o tratamento das células com um agente genotóxico ou outro que leve ao dano das moléculas de DNA, sendo as células posteriormente embebidas em agarose, numa lâmina de microscópio, sujeitas a lise com uma solução hipertónica contendo um detergente não-iónico que remove todas as membranas e proteínas citoplasmáticas, preservando, no entanto, a estrutura da cromatina nos núcleos. Estes são então sujeitos a condições alcalinas ou neutras, o que torna a estrutura da cromatina mais relaxada, expondo o DNA e permitindo que ao ser aplicada uma corrente elétrica os fragmentos de DNA danificados migrem mais que o DNA intacto. Após coloração com um marcador fluorescente específico de DNA (por exemplo, o brometo de etídio), o gel é então observado ao microscópio de fluorescência e através de um software apropriado calculada a percentagem de fluorescência existente na cabeça e na cauda do cometa, bem como o seu comprimento (A. R. Collins 2004; Nandhakumar et al. 2011). A percentagem de DNA fragmentado na cauda do cometa é uma medida direta dos danos no DNA.

Para avaliar a influência do estado de ativação da via Rac1/PAK1 na indução de danos no DNA e na capacidade de os reparar foi realizado um ensaio de cometa em células DLD1 em três condições diferentes de ativação desta via: condições basais; ativação da via, através do tratamento das células com HGF (do inglês, Hepatocyte Growth Factor), um fator de crescimento responsável pela ativação de Rac1; e inibição da via, pelo tratamento das células com EHT. Cada uma das condições anteriores foi exposta a um agente genotóxico, neste caso, o sulfonato de etil-metano (EMS) ou ao veículo no qual este agente foi dissolvido. Adicionalmente, o desenho experimental incluiu o tempo de recuperação 0 h e 4 h após a exposição, ou não, ao agente genotóxico. Todos os tratamentos foram feitos em duplicado para amostra. A Figura 3.1 apresenta um esquema resumindo o procedimento experimental atrás descrito.

Assim, prepararam-se células DLD1 com uma confluência de 40 a 50% (aproximadamente 0,25x105

células/poço) numa placa 24-well (Thermo Fisher Scientific). No dia seguinte mudou-se o meio para DMEM com apenas 1% (v/v) de FBS (DMEM 1%), um procedimento chamado de “starvation”. Este passo é essencial ser realizado antes das células serem tratadas com um fator de crescimento, dado que o soro (FBS) é também rico em fatores de crescimento e é importante anular o efeito desses antes de observarmos o resultado de outro tratamento. Passadas 24 h, com as células a uma confluência de cerca de 80%, procedeu-se ao tratamento com HGF (50 ng/ml), EHT (20 µM), ou apenas novo DMEM 1%, nos poços respetivos, durante 4 h. Durante este tempo as células foram incubadas a 37°C, com 5% de CO2.

Posteriormente, removeu-se o meio de todos os poços e lavou-se com PBS 1x (Gibco®_{, Thermo Fisher}

Scientific). Aos poços que não foram sujeitos a tratamento genotóxico foi adicionado DMEM 1%, enquanto aos outros foi adicionado 15 mM EMS diluído em DMEM 1% (500 µl/poço), durante 1 h, mantendo mais uma vez as células a 37°C, com 5% de CO2. Em seguida tirou-se o meio e lavaram-se

todos os poços com PBS. Aos poços que seriam avaliados após 4 h de recuperação da exposição ao EMS foi adicionado DMEM 1%. Quanto aos poços com 0 h de tempo de recuperação foi iniciado o processo de tripsinização (utilizando 300 µl de tripsina) e ficando a incubar durante sensivelmente 5 min na estufa a 37°C. Quando as células já se encontravam soltas, ressuspenderam-se em 600 µl de DMEM 1% e transferiu-se a suspensão celular para tubos de 1,5 ml. Procedeu-se à sua centrifugação a 1200 rpm, a 4°C, durante 10 min. Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante e os pellets foram ressuspendidos no volume residual remanescente.

Previamente, prepararam-se e identificaram-se lâminas revestidas com agarose (Electrophoresis grade, Sigma) e dissolveu-se 1% de low melting point agarose (composição no Anexo VI) a 70°C que, posteriormente, se colocou a 38°C e onde permaneceu até ser utilizada.

Às ressuspensões dos pellets anteriores foram adicionados 80 µL de 1% low melting point agarose (composição no Anexo VI) a 38°C. Esta mistura foi rapidamente homogeneizada e distribuída em duas gotas numa lâmina revestida com agarose (Fig. 3.2), colocando-se de imediato uma lamela por cima de cada gota e em seguida, posicionando a lâmina em cima de uma caixa metálica incubada no frio. Este procedimento dá origem à formação de mini-géis contendo os núcleos das células obtidos nas várias condições do ensaio. Terminada esta fase, as lâminas são protegidas da luz para evitar qualquer tipo de efeito genotóxico ambiental e deixadas a 4°C entre 10 a 15 min.

Figura 3.2 – Imagem representativa das lâminas com os mini-géis.

Por fim, depois de se retirarem as lamelas, as lâminas são embebidas em solução de lise (composição no Anexo VI) e incubadas entre 1 h a 24 h, a 4°C.

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O procedimento anterior foi repetido para as células com tempo de recuperação de 4 h, até que todas as lâminas se encontrassem em solução de lise.

Finalizado o processo de lise, incubaram-se as lâminas em tampão de eletroforese alcalino (composição no Anexo VI), previamente mantido a 4°C, já na tina de eletroforese, durante 30 min. Em seguida, realizou-se a eletroforese com uma voltagem constante de 28 V, durante 25 min, tentando manter a amperagem perto dos 300 mA. Após a eletroforese, colocaram-se as lâminas em tampão de neutralização (composição no Anexo VI) frio, durante 10 min, seguida de outra incubação de 10 min em água bidestilada fria. Por fim, deixaram-se as lâminas a secar O/N à temperatura ambiente.

No dia seguinte, iniciou-se o processo de coloração das lâminas para posterior análise. Este processo incluiu a adição de 20 µL de brometo de etídio (0,125 µg/µL) a cada mini-gel, cobrindo-se cada um deles com uma lamela e incubando em câmara húmida, protegida da luz, durante 30-45 min a 4°C. As lâminas foram observadas ao microscópio de fluorescência Zeiss AxioPlan2, acoplado a um sistema digital de aquisição de imagens. O software OpenComet (www.opencomet.org) foi usado para medir os cometas de 100 células entre os replicados de cada condição experimental.