Ensaio da Hidroxiprolina.

Para o ensaio da capacidade indutora da produção de colágeno (hidroxiprolina) foram analisados os hidrolisados dos tegumentos dos dorsos dos ratos com maior índice de cicatrização ou fechamento da ferida, sendo eles: Arrabidaea chica 10 mg/mL; nanopartículas de AH + A. chica - 1:0,5 (1500 e 200 rpm) 5 mg/mL e micropartículas de AH + A. chica - 1:0,5 (1500 e 1000 rpm) 5 mg/mL. Dentre todos os grupos avaliados, nenhum deles apresentou diferença na quantidade de hidroxiprolina nos tecidos cicatrizados quando comparados ao controle negativo absoluto salina (Figura 43).

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 Salina A. chica 10 mg/m L Nanopa rtículas + A. ch ica Micropa rtículas + A. ch ica C o n ce n tr aç ão d e H id ro xi p ro li n a (m g /m L )

Figura 43. Quantidade de hidroxiprolina no tecido cicatrizado de ratos. Grupos

avaliados: controle negativo absoluto salina; A. chica 10 mg/mL; nanopartículas de AH + A. chica - 1:0,5 (1500 e 200 rpm) 5 mg/mL e micropartículas de AH + A. chica - 1:0,5 (1500 e 1000 rpm) 5 mg/mL. As barras verticais representam o desvio padrão da média.

Esses dados sugerem que a atividade cicatrizante tanto do extrato bruto da A. chica livre quanto encapsulado em micro e nanopartículas de AH deve-se à

capacidade de estimulação do crescimento celular em fibroblastos (Figura 30), responsáveis pela contração da ferida e da indução do processo de angiogênese (Figuras 32, 36 e 37), responsável pela oxigenação e nutrição do tecido, ambos necessários para manter a continuidade tecidual, reduzir o tamanho da lesão, e facilitar a cicatrização (Branski et al, 2006; Clark, 1995; Carmeliet, 2005).

Podemos sugerir ainda que a maior atividade proporcionada pelo extrato bruto da A. chica livre e encapsulado em micro e nanopartículas de AH ocorre na segunda fase de cicatrização ou fase de proliferação (Vanlis & Kalssebeek, 1973; Dvorak et.al., 1999).

V. CONCLUSÕES

V. CONCLUSÕES

V. CONCLUSÕES

V. CONCLUSÕES

V. CONCLUSÕES.

Através dos resultados obtidos, podemos concluir de forma geral que as micro e nanopartículas de ácido hialurônico contendo o extrato bruto da A. chica produzidas neste trabalho, beneficiaram a angiogênese e cicatrização contribuindo assim para o desenvolvimento de novas formulações para aplicações farmacêuticas e cosméticas.

Como conclusões específicas têm-se:

• A formação e propriedades físico-químicas das partículas de AH produzidas por emulsificação são diretamente relacionadas com as variáveis operacionais. O processo de emulsificação produziu nano e micropartículas, cujo melhor rendimento foi 73%, com velocidade de agitação 1500 e 1000 rpm, razão ADH:AH 2:1, pH ajustado com 1 mL de HCl (0,1N), para 250 mL de meio reacional;

• O aumento da velocidade de agitação na segunda reação de reticulação aumentou o diâmetro das nanopartículas formadas. A velocidade de agitação de 200 rpm na segunda reação de reticulação favoreceu a formação de nanopartículas vazias. A velocidade de agitação de 1000 rpm na segunda reação de reticulação favoreceu a formação de micropartículas vazias;

• As micropartículas vazias apresentaram diâmetro médio de 4,19 µm e 3,36 µm, com características adequadas para a administração farmacológica e cosmética devido ao tamanho reduzido; as nanopartículas vazias obtidas apresentaram diâmetro médio de 119,27 nm e 523,95 nm;

• As micropartículas encapsulando o extrato bruto da A. chica apresentaram diâmetro médio de 2 – 6 µm, conservando as características para a administração farmacológica e cosmética devido ao tamanho reduzido;

• As nanopartículas contendo ativo da A. chica obtidas apresentaram diâmetro médio de 202 – 598 nm;

• As nanopartículas contendo A. chica apresentaram –se mais estáveis, com potencial zeta de +27,2 a +50 mV comparadas às partículas vazias que apresentaram valores de potencial zeta entre +15,2 e +40 mV;

• O rendimento tanto das partículas vazias quanto das contendo o ativo foi baixo, devido as grandes perdas durante as lavagens do processo para a retirada da fase oleosa, revelando a necessidade de se melhorar o processo de separação das partículas da fase oleosa;

• Apesar do baixo rendimento das partículas, a encapsulação de extrato bruto da A. chica mostrou-se eficiente, com eficiências acima de 40%;

• O crescimento celular em fibroblastos humanos, tanto as partículas vazias como o extrato da A. chica não apresentaram toxicidade celular, onde o extrato originário do Paraná apresentou características indutoras do crescimento celular superiores ao controle positivo alantoína;

• Ensaios in vivo realizados em CAM evidenciaram o efeito angiogênico das micropartículas vazias de AH e das diluições mais concentradas do extrato bruto;

• Ensaios in vivo realizados no tegumento do dorso de camundongos evidenciaram o efeito angiogênico das nanopartículas vazias de AH, de todas as micro e nanopartículas de AH contendo o extrato bruto da A. chica exceto nas micropartículas cuja proporção AH:A. chica foi de 1:1 , e ao contrário do encontrado em CAM, apenas nas diluições menos concentradas do extrato bruto foi possível verificar o aumento dos vasos sanguíneos;

• A análise microscópica dos cortes histológicos confirmou a atividade indutora da angiogênese evidenciada na contagem macroscópica dos vasos sanguíneos do tegumento do dorso de camundongos;

• No ensaio de cicatrização de ferida no tegumento do dorso de ratos tanto a A. chica livre quanto encapsulada em micro e nanopartículas de AH demonstraram um potencial cicatrizante expressivo devido ao fechamento rápido e eficiente da ferida, superior a 80% de área reduzida da ferida;

• O ensaio da capacidade indutora da produção de colágeno (hidroxiprolina) mostrou que tanto a tanto a A. chica livre quanto encapsulada em micro e nanopartículas de AH não apresentaram diferença na quantidade de hidroxiprolina nos tecidos cicatrizados quando comparados ao controle negativo absoluto salina;

• Pode-se inferir que a atividade cicatrizante tanto do extrato bruto da A. chicalivre quanto encapsulado em micro e nanopartículas de AH deve-se à capacidade de estimulação do crescimento celular em fibroblastos e da indução do processo de angiogênese, ambos os eventos ocorrendo na segunda fase de cicatrização ou fase de proliferação.