Ensaio de complementação da MsmK_K44A em B. subtilis

2.11.1 Construção dos plasmídeos

Foi desenvolvido um sistema que permite acompanhar o crescimento bacteriano de Bacillus subtilis em que o metabolismo da única fonte de carbono arabinotriose está condicionalmente dependente da MsmX, DLN do transportador de arabinotriose, ou de homólogos de MsmX [77]. Foi igualmente demonstrado que a proteína MsmK de S. pneumoniae, não existente em B. subtilis, é capaz de complementar a função de MsmX (este sistema será discutido em detalhe na secção 3.8) [78], [Sara Silva, manuscrito em preparação]. Com base neste sistema, decidiu-se testar a influência da mutação K44A na MsmK em B. subtilis IQB495 usando o plasmídeo pPS7 (Figura 2.2) [78], [Sara Silva, manuscrito em preparação].

Figura 2.2: Representação do pPS7 (Anexo 6.10) assim como a sequência expressa da MsmX+LEH6 usada no trabalho. A sublinhado encontram-se representados os aminoácidos não nativos presentes na sequência expressa da MsmX.

A partir do plasmídeo pET30+MsmK+LEH6_K44A, amplificou-se a sequência com a mutação por PCR com os primers ARA773 e ARA774 (Tabela 2.4), digerindo-se com as respetivas enzimas de restrição e purificando-se a banda obtida (secção 2.2). O plasmídeo pPS7 (Figura 2.2) digerido com Bglll e NheI foi purificado em gel de agarose 1% (m/ V). E a sequência de msmX substituída por inserção de msmK mutado através da ligação dos dois fragmentos (Anexo 6.10). A inserção, amplificação, purificação e sequenciação da sequência de MsmK_K44A seguiram o procedimento descrito na secção 2.2.

Tabela 2.4: Oigonucleótedos com as respetivas sequências usados para a construção do plasmideo MsmK+LEH6.usado no ensaio in vivo. A sublinhado encontra-se indicado a zona de corte

Oligonucleótidos Sequência (5’->3’) Informações adicionais ARA774 GCCGCCAGATCTTTTTTCAGTTTCTAC MsmK com local BglII

ARA773 CACCTCATGGCTAGCTTGAATCTTA MsmK com local NheI

ARA840 TGAACGCTCTCCTGAGTA Usado na sequenciação

Lac_R GGCATACTCTGCGACATCGT Usado na sequenciação

2.11.2 Transformação em B. subtilis IQB495

Um inóculo da estirpe B. subtilis IQB495 (Anexo 6.11) crescido em 3 mL de meio LB com cloranfenicol (5 µg/ mL) durante a noite a 37ºC foi diluído 50 vezes em 10 mL meio SP (2% (m/ V) glucose, 0,1% (m/ V) caseína hidrolisada, 5 µg/ mL L-triptofano, 2,2 µg/ mL citrato de ferro amoniacal, 0,2% (m/ V) glutamato de potássio e 3 mM MgSO4 emtampão fosfato citrato. A amostra foi colocada a 37ºC e a 150 rpm registando-se a DO600nm ao longo do tempo (espetrofotómetro UV/ Visível, leituras a cada 60 min). Após 60 min de se verificar ausência de crescimento exponencial, adicionou-se 500 ng do plasmídeo pretendido deixando-se a solução nas mesmas condições por mais 60 min ao fim dos quais se semearam 150 µL em placas contendo LA com espectinomicina (60 µg/ mL) e cloranfenicol (20 µg/ mL) que se colocaram a 37ºC durante a noite. As colónias obtidas no processo de transformação

foram inoculadas em placas de Tryptose Blood Agar Base (TBAB) com 1% (m/ V) de amido colocando-se a 37ºC durante a noite. As placas foram expostas a uma solução de I^-/I2 (5 mL de solução 0,2% (m/

V) de I2 e 2% (m/ V) de KI) e quatro das colónias incapazes de digerir o amido, Amy(-), foram transferidas para uma nova placa LA com espectinomicina (60 µg/ mL) e cloranfenicol (20 µg/ mL) e incubadas durante a noite a 37ºC, descartando-se as outras culturas

2.11.3 Determinação dos parâmetros cinéticos de crescimento

A partir de uma placa LA fresca (menos de 48h depois de inocular) a(s) estirpe(s) de B. subtilis derivadas de IQB495 foi deixada a crescer em 5 mL de meio CSK (meio C mínimo suplementado com 100 µg/ mL triptofano e 8 µg/ mL glutamato de potássio) com succinato de potássio (6 µg/ mL), espectinomicina (60 µg/ mL) e cloranfenicol (20 µg/ mL) [88]. Após incubação durante a noite a 37 ºC e 150 rpm, as células foram lavadas três vezes através da sua deposição por centrifugação (1 min, 13000 rpm) e posterior ressuspensão em meio CSK. A partir desta suspensão, foram preparadas duas culturas de 1 mL com uma DO600nm de 0,05 em meio CSK com 0,1% (m/ V) de arabinotriose (95%

pureza, Megazyme International Ireland Ltd.) adicionando-se IPTG para uma concentração final de 1 mM a uma das culturas. As culturas foram preparadas em tubos Falcon estéreis de 50 mL (Sarstedt), incubados a 37ºC e a 180 rpm, sendo a DO600nm medida no tempo inicial, passado 2 h e, por fim, de 45 em 45 min até se obter pelo menos cinco pontos em fase exponencial do crescimento. Os crescimentos celulares foram efetuados num agitador orbital com banho maria Aquatron® e monitorizados pela densidade ótica a 600nm (DO600nm) por espetrofotometria UV/ Visível (espetrofotómetro Ultraspec^TM 2100).

2.11.4 Western-Blot dos extratos celulares

Para a análise de proteínas através da técnica de Western-Blot, foi efetuado um novo crescimento das culturas de acordo com o descrito na secção 2.11.3 com uso de 5 mL de meio CSK e da troca do açúcar arabinotriose por arabinose (Sigma Aldrich). Neste caso, o crescimento foi acompanhado de hora-a-hora. Após se atingir uma DO600nm compreendida entre 0,9 e 1,1, as células foram depositadas por centrifugação (5 min, 5 000 rpm) e ressuspendidas em tampão lise (500 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glicerol, pH 7,6) com 10 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF, solução stock de 100 mM em isopropanol), procedendo-se a uma nova centrifugação e remoção da fase solúvel (células guardadas a -20ºC). A lise celular foi efetuada ressuspendendo as células em 75 µL de tampão lise, adicionando-se lisozima para uma concentração final de 1 mg/mL. A mistura foi incubada durante 10 min a 37ºC. Adicionou-se 9 L de PMSF e 1 L benzonase (solução stock a 2.5 U/L) à mistura, seguindo-se três ciclos de congelamento em azoto líquido com intervalos de 5 min a 37ºC. A quantidade de proteína total foi determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). Após a quantificação dos extratos, 10 µg de proteína total e 0,6 µg proteína purificada por IMAC e SEC (MsmX+LEH6 ou MsmK+LEH6, dependendo da análise) foram aplicados num gel SDS-PAGE (procedimento na secção 2.5) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose por electrotransferência (Bio-Rad Mini-Trans-Blot® Transfer System) a 100 V durante 30 min. Após isto, as membranas foram coradas com Ponceau S e a membrana deixada a bloquear em PBS-Tween20 0,1%

(Sigma Aldrich), solução bloqueio, com 4% (m/ V) leite em pó não gordo (NZYTech) com agitação média, durante 30 min a temperatura ambiente. Depois de lavada em solução bloqueio por 15 min, a membrana foi transferida para 10 mL de solução bloqueio com o anticorpo primário (anticorpo monoclonal de rato Anti-6X His-tag®, HIS.H8, Abcam) diluído 1 000 vezes durante uma hora sendo depois lavada duas vezes em 10 mL solução de bloqueio com períodos de incubação de 10 min.

Posteriormente, incubou-se a membrana com o anticorpo secundário (anticorpo HPR-conjugado de burro anti lgG de rato, Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.) nas mesmas condições que o primário procedendo-se de novo às lavagens. Os passos seguintes do procedimento foram efetuados na câmara escura. O excesso de tampão foi removido das membranas em papel absorvente (tendo o cuidado de não deixar secar) e depois tratadas com 1 mL solução luminescente (SuperSignal^TM West Pico Chemiluminescente Subtract, Thermo Scientific). As chapas de radiografia (Amersham Hyperfilm plate, GE Healthcare) foram expostas às membranas numa cassete (Hypercassette Autoradiography Cassette, GE Healthcare) por diferentes tempos (5 seg, 20 seg e 1 min) sendo depois reveladas.