Ensaio de transporte e afinidade por aminoácidos

Foram realizados experimentos de complementação com as leveduras mutantes 22∆8AA, 22∆6AAL e JA248 carregando as sequências do cDNA dos genes OsAAP1e

OsAAP18 na WSU. O gene OsAAP6 de arroz (Os01g65670) também foi utilizado neste experimento para comparação com os demais. A construção pDR195 carregando o cDNA de

OsAAP6 foi obtida seguindo o mesmo protocolo utilizado para a clonagem de OsAAP1e

OsAAP18 nas leveduras. Os testes de transporte foram realizados em duplicata com células oriundas de duas colônias independentes para cada linhagem com quatro repetições. Foram utilizadas como controle negativo células de colônias transformadas com o vetor pDR195 vazio, e como controle positivo e negativo células transformadas com os pDR195 carregando as sequencias dos transportadores de aminoácidos já caracterizados AtAAP3, AtAAP6 e

AtLHT2. Foram multiplicadas leveduras transformadas com o vetor pDR195 carregando o cDNA de AtAAP3 (OKUMOTO et al., 2004), AtAAP6 e AtLHT2 (LEE e TEGEDER, 2004)a partir de células estocadas em glicerol a -80°C em coleção existente no laboratório da WSU para realização dos testes.

Para os testes com 22∆8AA foram utilizados como controle pDR195 carregando as sequências dos genes AtAAP3ou AtAAP6, para os testes com 22∆6AAL foi utilizado pDR195 carregando as sequências de AtAAP3ou AtLHT2 e para os teste com JA248 foram utilizados pDR195 carregando as sequências de AtAAP3, AtAAP6ouAtLHT2.Foram utilizados os meios com aminoácidos em concentração seletiva para transporte nas diferentes linhagens mutantes (Tabela 8). Testes de complementação com as cepas da levedura 22∆8AA foram desenvolvidos sobre meio livre de nitrogênio ao qual foi adicionado 1, 3, ou 6mM de L- prolina, L-citrulina, L-aspartato ou L –glutamato como única fonte de N. Testes de complementação com a cepa JA248 foram desenvolvidos em meio livre de N complementado com 0,5, 1, 2 ou 5mM de L-glutamina como única fonte de N.

Testes de complementação com as cepas da levedura 22∆8AA foram desenvolvidos sobre meio livre de nitrogênio ao qual foi adicionado 10, 30 ou 50mM de lisina. Foram utilizadas placas com meios que permitem que todas as leveduras, independetemente da construção, cresçam como controle positivo para o meio, chamado meio não seletivo. Para aslinhagens 22∆8AA e JA248, o meio não seletivo foi BA+ 10mM de (NH4)2SO4, enquanto

para a linhagem 22∆6AAL os meios utilizados foram BA + 0,5g/l de Uréia + 500µM de lys- aps e BA+0,5g/l de uréia +1mM de lisina (Tabela 8).Colônias isoladas das leveduras foram utilizadas para inocular nos meios adequados e incubadas a 27°C até o aparecimento das colônias (cerca de 3 dias), que foram comparadas às colônias das placas controle para cada linhagem. As construções foram enviadas para seqüenciamento no Laboratório de Genômica da WSU antes da realização dos testes de transporte.

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4.5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram realizados testes iniciais com a concentração de 1mM para arginina, aspartato, citrulina, GABA, glutamato e prolina com a cepa mutante 22∆8AA (Figura 31). Os resultados desse teste confirmaram que essa concentração estava adequada para o teste de afinidade por substrato, uma vez que foi possível verificar diferenças entre os controles e os genes testados. Sendo assim, não houve necessidade de realização de testes com as concentrações previamente escolhidas de 3 e 6mM.

A realização de testes iniciais e escolha de uma concentração mínima para determinação da capacidade de transporte das cepas transformadas foi de extrema importância, uma vez que concentrações maiores dos aminoácidos a serem testados podem resultar em meio de cultivo não seletivo para transporte, ou seja, com impossibilidade de distinguir a afinidade dos transportadores pelo substrato. Essa concentração mínima de aminoácidos nos testes é variável entre diferentes transportadores. A concentração de 1mM foi utilizada em trabalhos para testar diferentes transportadores, mostrando-se adequada para seleção de afinidade de transporte para prolina (OKUMOTO et al., 2002; LEE eTEGEDER, 2004), citrulina (OKUMOTO et al., 2002), glutamato (OKUMOTO et al., 2002; LEE e TEGEDER, 2004), aspartato (OKUMOTO et al., 2002; FISCHER et al., 2002) e arginina (OKUMOTO et al., 2002, HIRNER etal., 2006). No entanto, deve-se atentar para possível necessidade de uso de concentrações maiores dos substratos no caso de transportadores de aminoácidos que apresentam baixa afinidade.

A complementação de leveduras com OsAAP1 inserido no pRD195 restaurou a capacidade de crescimento na cepa mutante 22∆8AA em meio enriquecido com 1mM de arginina, aspartato, citrulina, glutamato ouprolina como única fonte de N (Figura 31).

OsAAP1 também mostrou a capacidade de sustentar o crescimento dacepa mutante 22∆6AAL em meio suplementado com lisina como única fonte de N mesmo na concentração mais baixa, de 10µM (Figura 32).

Foi verificado que os meios utilizados para os testes de complementação com a levedura JA248 possibilitaram o crescimento de todas as construções testadas, inclusive as leveduras que receberam o vetor pDR195 vazio, mesmo na menor concentração, de 0,01mM de glutamina (Figura 33). Isso caracteriza um meio não seletivo, ou seja, que possibilita o crescimento de todas as células. Sendo assim, como não houve o estabelecimento de uma dose seletiva de glutamina não foi possível verificar a capacidade de transporte desse aminoácido por OsAAP1 no experimento. Além disso, existe a possibilidade do teste com a cepa JA248 não mostrar resultados de seleção devido a problemas com a cepa, como por exemplocontaminação com cepas não mutantes.

Os resultados indicam a capacidade de transporte de ampla gama de aminoácidos pelo transportador OsAAP1, embora não seja possível indicar os parâmetros cinéticos de transporte desses aminoácidos, uma vez que não foram determinados o Km e Vmax. Para determinar esses

parâmetros seriam necessários testes de absorção desenvolvidos com aminoácidos marcados (14C), o que não foi possível ser realizado na WSU, apesar da universidade possuir toda a infra-estrutura necessária para realização dos testes, devido ao curto tempo disponível para realização dos experimentos nos Estados Unidos. Esses resultados estão de acordo com os observados para o transportador AAP1 de Arabidopsis. LEE et al. (2007) verificaram através de estudos de complementação em leveduras que o transportador AAP1 de Arabidopsisapresenta a capacidade de transporte de prolina, e através de estudos com plantas mutantes, observaram que glutamato, histidina e aminoácidos neutros, incluindo fenilalanina, são substrato para AAP1.

61 O amplo espectro de aminoácidos pelos quais OsAAP1 tem afinidade pode representar um papel desse transportador no transporte de N orgânico em diferentes fases de desenvolvimento da planta, e em diferentes órgãos,apresentando distintos padrões cinéticos de acordo com o substrato. Além disso, o fato de OsAAP1 transportar diferentes aminoácidos pode indicar função de compensação quando algum outro transportador não é expresso, ou redundância de funções. O amplo espectro de aminoácidos transportados por OsAAP1 pode estar ligado ao fato da mutação nesse gene não ter reduzido a produção de plantas mutantes

Osaap1 como descrito no capítulo 1, uma vez que outros transportadores com afinidade para os mesmos aminoácidos podem compensar sua ação.

A complementação de leveduras com OsAAP18 inserido no pRD195 não restaurou a capacidade de crescimento em nenhum dos meios testados. Resultados de seqüenciamento comprovaram erro na sequencia de OsAAP18 inserida em pDR195, invalidando os resultados verificados para essa construção. Com isso, não pode ser afirmado que osAAP18 não é capaz de transportar os aminoácidos testados, uma vez que a ausência de crescimento deve ter ocorrido pelo erro na sequência codante inserida.

Figura 31. Teste de afinidade dos transportadores OsAAP1, OsAAP6 e OsAAP18 por

substrato a 1mM (aminoácidos arginina, aspartato, citrulina, GABA, glutamato e prolina) com colônias das leveduras 22∆8AA. O meio BA enriquecido com 10mM de (NH4)2SO4

foi utilizado como controle positivo para cultivo. Leveduras da cepa 22∆8AA carregando vetor vazio (pDR195) foram utilizadas como controle negativo para o teste. Leveduras 22∆8AA carregando a sequência dos genes AtAAP3 e AtAAP6foram utilizadas como controle positivo.

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Figura 32.Teste de afinidade de OsAAP1, OsAAP6e OsAAP18 por substrato (lisina) em

meio BA com concentrações de 10, 30 e 50 µMutilizando colônias das leveduras 22∆6AAL. O meio BA enriquecido com 0,5g/l de uréia + 1mM de lisina foi utilizado como controle positivo. Leveduras da cepa 22∆6AAL carregando vetor vazio (pDR195) foram utilizadas como controle negativo para o teste. Leveduras 22∆6AAL carregando a sequência dos genes AtAAP3 e AtLHT2 foram utilizadas como controle positivo.

Figura 33. Teste de afinidade de OsAAP1 e OsAAP6 por susbtrato (glutamina) em meio BA

com 0,5 e 1mM de glutaminautilizando cepas das leveduras mutantes JA248. O meio BA enriquecido com 10mM de (NH4)2SO4 foi utilizado como controle positivo para cultivo.

Leveduras da cepa JA248 carregando vetor vazio (pDR195) foram utilizadas como controle negativo para o teste. Leveduras JA248 carregando a sequência dos genes

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4.6. CONCLUSÕES

Os resultados sugerem que OsAAP1 tem capacidade de transportar amplo espectro de aminoácidos, o que indica um papel importante no processo de transporte de N na forma orgânica em plantas de arroz.

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