Ensaio de viabilidade celular por sulforrodamina em queratinócitos HaCaT

Para avaliar se o impedimento da migração celular nos compartimentos tratados com o extrato da casca não ocorreu por uma morte significativa de células da linhagem HaCaT, foi realizado o ensaio de viabilidade celular com sulforrodamina B. Este método permite observar a viabilidade pela correlação com o conteúdo de proteínas em células viáveis. No momento da fixação somente células viáveis permanecem e somente estas são coradas. Os resultados obtidos foram avaliados e não houve diferença estatística entre as absorbâncias das células tratadas com a casca e daquelas tratadas com meio sem enriquecimento e com o extrato das sementes. Um cálculo da porcentagem de células viáveis para cada tratamento foi realizado utilizando o meio enriquecido com SFB 5% como controle de 100% de viabilidade. Assim, foi possível concluir que as células tratadas com meio sem enriquecimento e com os extratos das sementes e da casca apresentaram menor porcentagem de viabilidade quando comparadas àquelas tratadas com o meio enriquecido com SFB 5%, mas apesar da viabilidade ser menor, em todos os tratamentos as porcentagens de viabilidade celular permaneceram acima dos 70%. Portanto, de acordo com os resultados obtidos, as células presentes nos poços tratados com extrato da casca em suas duas concentrações estavam viáveis ao final do experimento, demonstrando que provavelmente o que ocorreu foi mesmo uma inibição do processo de migração celular e não ação citocida (Tabela 7). Apesar de não apresentar atividade citocida, o extrato da casca pode ter apresentado uma ação citostática para a linhagem testada.

Tabela 7: Porcentagem de células viáveis ao final do ensaio de migração celular com HaCaT. Porcentagem de células viáveis

Tratamento Concentração da amostra (μg/mL) Viabilidade (%)

Meio enriquecido SFB 5% - 100 ± 0

Meio sem SFB 5% - 77 ± 2,68

Extrato das sementes 3,6 80 ±3,32

Extrato das sementes 1,8 74 ± 2,61

Extrato da casca 36 72 ± 0,46

5.6. Análise do ciclo celular

Esta análise do ciclo celular permite determinar as diferentes fases através do conteúdo de DNA. O iodeto de propídio é utilizado por ser um intercalante de DNA, portanto, o número de células presentes em cada fase do ciclo é indicado através da intensidade de sua fluorescência. A leitura, então, permite observar as fases G1, cuja característica é ter conteúdo de DNA 2 C, G2/M, com o dobro da quantidade de DNA (4 C) e S, na qual o conteúdo de DNA está entre 2 C e 4 C (Paiva, 2016). Após 48 horas, o tratamento com o extrato da casca na concentração de 25 μg/mL levou a uma diminuição da subpopulação de células U251 na fase G1. Nenhuma alteração significante foi observada para a concentração de 2,5 μg/mL (Figura 8). Em relação ao tratamento com o extrato das sementes, foi possível observar, após 48 horas, um aumento na subpopulação de células de glioma tratadas com ambas as concentrações (2,5 e 25 μg/mL) na fase G2/M e diminuição da subpopulação da fase G1. Não ocorreram mudanças significativas na subpopulação de células em fase S (Figura 8).

Compostos capazes de parar o ciclo celular de células tumorais têm sido cada vez mais visados para o tratamento do câncer e os nossos achados indicam que os extratos de araticum possuem grande potencial neste sentido, principalmente o extrato das sementes, desde que sejam específicos. Estudos futuros devem visar o isolamento dos compostos responsáveis pela parada do ciclo celular, garantindo a especificidade desta ação (Androutsopoulos & Spandidos, 2018). A atividade antiproliferativa observada pelo ensaio de SRB para o extrato das sementes condiz com os achados relacionados à parada do ciclo celular na fase G2/M e estes sugerem uma ação sobre o fuso mitótico. Um agente anti- mitótico conhecido por induzir parada no ciclo celular na fase G2/M é a colchicina, um alcaloide que inibe a formação do microtúbulo por meio da ligação entre os monômeros α e β da tubulina. Apesar de ser efetiva, sua toxicidade e consequentes efeitos adversos fazem com que seu uso seja restrito (Lu et al., 2012; Paiva, 2016).

O extrato etanólico das sementes do araticum foi descrito como citogenotóxico, capaz de agir inibindo a mitose e causando danos nos cromossomos e no núcleo. Os fenóis, por exemplo, podem inibir a divisão celular (Ribeiro et al., 2013). É extremamente importante a descoberta de compostos que consigam parar o ciclo celular em G2/M e não tenham alta toxicidade como a colchicina. Alguns alcaloides, flavonoides e taninos que já foram descritos por sua ação na parada do ciclo celular e pelo estímulo da apoptose de células tumorais e

podem ser os responsáveis pelos resultados observados (Ribeiro et al., 2013; Cai et al., 2017; George et al., 2017).

Figura 8: Análise do comportamento do extrato das sementes e do extrato da casca de araticum nas fases do ciclo celular. * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001, diferença estatisticamente significante em relação ao grupo controle negativo (Two way ANOVA – seguido pelo teste Bonferroni).

Jeong et al., (2009) investigaram a ação da quercetina como indutor de parada do ciclo celular em células tumorais de mama (SK-Br3) e os resultados demonstraram que este composto induziu parada na fase G1 em sua menor concentração. O extrato das sementes também induziu parada do ciclo celular na fase G1 e esta ação também foi mais efetiva em sua menor dose. O extrato das sementes possui 21,11 μg/g de quercetina. A quantidade de quercetina no extrato da casca ficou abaixo do limite de quantificação. O extrato da casca

também apresentou valores menores que o limite de quantificação para naringenina, enquanto o extrato das sementes apresentou 0,31 μg/g. A naringenina já foi descrita por induzir parada nas fases G1 e G2/M do ciclo celular de células de carcinoma hepatocelular (HepG2) (Arul & Subramanian, 2013). Os resultados obtidos sugerem um potencial como quimioterápico para ambos os extratos, principalmente para o extrato das sementes.