Ensaio dos sanitizantes em células de S Heidelberg aderidas

4.4 Resistência a sanitizantes

4.4.3 Método 2 – Resistência a sanitizantes, segundo método

4.4.3.2 Ensaio dos sanitizantes em células de S Heidelberg aderidas

Os corpos de prova foram lavados com detergente neutro, enxaguados e secos em estufa. Os corpos de prova foram esterilizados em autoclave a 121°C, por 15 minutos em frasco estéril e mantidos a temperatura ambiente.

Um corpo de prova de aço inoxidável foi imerso em 10mL do pool de S. Heidelberg previamente ajustado a 108 UFC/mL, e incubado a 37°C, por 15 minutos. Durante esse período ocorreu a adesão de células bacterianas na superfície do corpo-de-prova e, em seguida, esse foi lavado com água peptonada 0,1% estéril, para remoção das células pouco aderidas. O corpo de prova foi, então, imerso em 10mL de solução sanitizante preparada conforme a CIM. O corpo de prova foi novamente lavado com água peptonada 0,1% estéril e transferido para um frasco contendo 10mL de água peptonada 0,1% e submetido ao equipamento de ultrassom Ultracleaner USC-1400A, Unique, com potência de 40 Hz, por 10 minutos, para a liberação das células aderidas. Quatro diluições decimais foram preparadas a partir da água peptonada sonicada, sendo que 20µL dessas foram dispostas em forma de gota, em ágar BHI, e incubadas a 37°C/24h (MILLES & MISRA, 1938). As colônias formadas foram contabilizadas, e o resultado foi calculado em log de UFC/cm2 (ENGEL et al., 2017).

O ensaio foi realizado com diluições dos sanitizantes nas concentrações referentes a metade do valor do CIM, bem como o dobro dessa concentração. Os tempos de contato do corpo de prova contendo células aderidas com as soluções de sanitizantes foram de 1 e 10 minutos.

O controle negativo foi realizado colocando o corpo de prova em contato com água peptonada 0,1% por um período de 10 minutos e levado ao sonicador. Uma alíquota de 20µL foi semeada em ágar BHI, pelo método da gota, e incubados a 37°C/24 horas.

O controle positivo foi realizado com o corpo-de-prova de aço inoxidável imerso em 10mL do pool bacteriano e incubado a 37°C, por 15 minutos. Transcorrido o tempo de contato, foram feitas duas lavagens com água peptonada 0,1% e transferido para outro frasco contendo 10mL de água peptonada 0,1%. Esse foi sonicado por 10 minutos, e alíquotas de quatro diluições decimais foram semeadas em ágar BHI, através do método da gota. As placas foram incubadas a 37°C/24 horas. O resultado foi calculado em log UFC/cm2. Foram realizadas pelo menos três repetições de cada concentração dos sanitizantes.

4.5 Análise estatística

Através do programa estatístico PAST 3.16, os resultados da tipificação molecular por PCR-Ribotipificação e do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foram analisados. Com os dados obtidos foram elaborados dois dendrogramas os quais reuniram os isolados com características semelhantes em grupos. Com o programa Excel 2010, os resultados de resistência aos sanitizantes foram analisados.

5 RESULTADOS

5.1 Tipificação molecular 5.1.1 PCR-Ribotipificação

A técnica de PCR-Ribotipificação permitiu agrupar os 173 isolados de S. Heidelberg em três perfis distintos. O perfil A, característico para 53 cepas, 30,7%, apresentou duas bandas de DNA, com tamanhos de 750 e 950pb. O perfil B, o qual agrupou 46,8%, equivalente a 81 cepas, apresentou três bandas de DNA nos tamanhos de 750, 900 e 950pb. O perfil C, característico de 21,4%, reuniu 39 cepas, apresentou quatro bandas de DNA, sendo elas de 750, 900, 950 e 1000pb.

As Figuras 4, 5 e 6 apresentam os três perfis de PCR-Ribotipificação, em gel de agarose, apresentando duas, três e quatro bandas de DNA, respectivamente.

Figura 4: Perfil de bandas A, de S. Heidelberg isoladas de carcaças de frango tipificadas por PCR-Ribotipificação. As canaletas de 501 a 508 apresentam os perfis de isolados de S. Heidelberg, enquanto que a canaleta M indica o padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder.

Fonte: a autora, 2017. pb pb pb pb

Figura 5: Perfil de bandas B, de S. Heidelberg isoladas de carcaças de frango tipificadas por PCR-Ribotipificação. As canaletas de 301 a 308 apresentam os perfis de isolados de S. Heidelberg, enquanto que a canaleta M indica o padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder.

Fonte: a autora, 2017.

Figura 6: Perfil de bandas C, de S. Heidelberg isoladas de carcaças de frango tipificadas por PCR-Ribotipificação. As canaletas de 117 a 122 apresentam os perfis de isolados de S. Heidelberg, enquanto que a canaleta M indica o padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder.

Fonte: a autora, 2017.

5.2 Susceptibilidade a antimicrobianos

Na Figura 7 estão descritos os vinte e oito perfis de resistência aos antimicrobianos utilizados no ensaio. O perfil que reuniu o maior número de cepas (59) reuniu 34,1% das cepas e apresentou resistência à Ceftriaxona, Sulfonamida, Ampicilina, Cefazolina, Tetraciclina e à Cefoxitina. O segundo perfil com maior pb

número de cepas (30) agrupou 17,3% e foram resistentes à Ceftriaxona, Sulfonamida, Ampicilina, Cefazolina, Tetraciclina, Cefoxitina e à Ciprofloxacina.

Outro dado importante demonstra que 86,1% dos isolados apresentaram multirresistência, ou seja, foram resistentes a três ou a mais classes de antimicrobianos. Dentre esses, 79,2% apresentaram resistência a pelo menos seis dos antimicrobianos testados.

Dentre os antimicrobianos com menor eficiência estão a Sulfonamida, na qual 97,7% dos isolados foram resistentes, seguido de Tetraciclina, com 95,5% e Cefazolina com 83,8%. Após, classificam-se Ampicilina e Ceftriaxona com índice de 77,5% de resistência e, com 64,7%, a Cefoxitina.

Os resultados relativos ao antimicrobiano Ciprofloxacina, da classe das quinolonas, demonstraram que 32,9% dos isolados apresentaram resistência, 67,1% apresentaram resistência intermediária e nenhum dos isolados foi susceptível.

Figura 7: Perfis de resistência dos isolados de S. Heidelberg obtidos pelo ensaio susceptibilidade a antimicrobianos, segundo CLSI, 2015.

Nota: Ampicilina (AMP); Cefazolina (CFZ); Cefoxitina (CFO); Ceftriaxona (CRO); Ciprofloxacina (CIP); Cloranfenicol (CLO); Estreptomicina (EST); Gentamicina (GEN) Imipenem (IMP); Tetraciclina (TET); Sulfonamida (SUL). Fonte: a autora, 2017.

1 2 1 1 17 1 5 1 1 3 1 1 14 1 1 1 1 1 59 2 30 6 4 2 1 9 2 2 CIP SUL SUL/CFZSUL/CIP SUL/TET SUL/TET/EST SUL/TET/CFZ SUL/TET/IMPSUL/TET/CIP SUL/TET/CIP/CFZ SUL/TET/CIP/EST SUL/CFZ/CRO/IMP SUL/TET/CFZ/CRO/AMPSUL/TET/CFZ/AMP/CFO TET/CFZ/CRO/AMP/CFOSUL/TET/CFZ/CIP/GEN SUL/TET/CIP/EST/GEN SUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP SUL/TET/CFZ/CRO/AMP/CFOSUL/TET/CFZ/CRO/AMP/EST SUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/CFO SUL/TET/CFZ/CRO/AMP/CFO/EST SUL/TET/CFZ/CRO/AMP/CFO/IMPSUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/GEN SUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/CFO/GENSUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/CFO/EST SUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/EST/GEN SUL/TET/CIP/CFZ/CRO/AMP/CFO/EST/IMP

Na Figura 8, apresenta-se o padrão de susceptibilidade dos isolados de S. Heidelberg em relação aos onze antimicrobianos testados distribuídos na forma de gráfico em colunas. Nele, é possível visualizar que a maioria dos isolados apresentou resistência ou resistência intermediária a sete dos onze antimicrobianos de quatro classes diferentes.

Em relação à susceptibilidade, as maiores percentagens foram referentes a Cloranfenicol, em que 100% dos isolados foram susceptíveis, seguidas de 95,6%, para a Gentamicina, 71,1%, para o Imipenem e 41,6% para a Estreptomicina.

Na Figura 9, consta o dendrograma formado a partir da classificação da susceptibilidade dos isolados, utilizando o programa PAST 3.16. Nele, é possível identificar cinco clusters os quais são identificados pelas chaves destacadas pelas setas. Os isolados reunidos nos clusters apresentam semelhanças em relação aos dados da susceptibilidade de cada antimicrobiano. Quanto mais distante da base do gráfico, tanto mais diferentes são as características dos isolados. O cluster C1 é

formado por apenas dois isolados (P709, P723) com características principais de susceptibilidade à Cloranfenicol, à Cefoxitina e à Ampicilina e resistente ou com resistência intermediária em relação aos demais antimicrobianos. O cluster C2, com

oito isolados, apresentou, como característica principal, a susceptibilidade à Tetraciclina, diferentemente do todos os outros isolados que foram resistentes a ele.

Figura 8: Padrão de susceptibilidade antimicrobiana de isolados de S. Heidelberg isolados de carcaças de frango.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

CLO IMP GEN EST AMP CFZ CFO CRO CIP SUL TET

N º d e is o la d o s Antimicrobianos

Resistente

Intermediário

Sensível

Figura 9: Dendrograma com os dados do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos dos 173 S. Heidelberg isoladas de carcaças de frango.

Nota: As setas assinalam os clusters formados a partir das semelhanças entre os isolados. Fonte: a autora, 2017. C2 C5 C3 C4 C1

Um segundo cluster, C3, reuniu vinte e nove isolados que demonstraram

características de maior sensibilidade, sendo suscetíveis entre quatro e oito antimicrobianos. Todos os isolados desse cluster foram resistentes à Sulfonamida e à Tetraciclina. O cluster C4, também com oito isolados, apresentou resistência a,

pelo menos, seis antimicrobianos, à Ampicilina, à Ceftriaxona, à Cefazolina, à Ciprofloxacina, à Sulfonamida e à Tetraciclina. O cluster C5, com maior número de

isolados (126), em sua maioria, foi resistente à Cefoxitina, à Ampicilina, à Ceftriaxona, à Cefazolina, à Ciprofloxacina, à Sulfonamida e à Tetraciclina e sensíveis à Cloranfenicol, à Gentamicina, à Imipenem e à Estreptomicina, com algumas variações de resistência intermediária.

Na Tabela 5, consta o número total de isolados de S. Heidelberg e seu respectivo percentual de resistência, resistência intermediária e de susceptibilidade aos antimicrobianos testados.

Tabela 5: Número total e percentual dos 173 isolados de S. Heidelberg susceptíveis,

com resistências intermediárias e resistentes em relação a cada antimicrobiano testado.

Antimicrobiano Susceptíveis Resistência Intermediária Resistentes

Nº % Nº % Nº % Cloranfenicol (CLO) 173 100,0 0 0,0 0 0,0 Gentamicina (GEN) 165 95,4 1 0,6 7 4,0 Imipenem (IMP) 123 71,1 42 24,3 8 4,6 Estreptomicina (EST) 72 41,6 76 43,9 25 14,5 Ciprofloxacina (CIP) 0 0,0 116 67,1 57 32,9 Cefoxitina (CFO) 53 30,7 8 4,6 112 64,7 Ceftriaxona (CRO) 18 10,4 21 12,1 134 77,5 Ampicilina (AMP) 39 22,5 0 0,0 134 77,5 Cefazolina (CFZ) 8 4,6 20 11,6 145 83,8 Tetraciclina (TET) 8 4,6 0 0,0 165 95,4 Sulfonamida (SUL) 1 0,6 3 1,7 169 97,7 Fonte: a autora, 2016.

Os dados de tipificação molecular foram cruzados com os dados do perfil de susceptibilidade e foi elaborado um segundo dendrograma com o programa PAST 3.16. Na Figura 10, está representada a imagem do dendrograma obtido em que é possível identificar, novamente, vários clusters nos quais estão reunidos os isolados com características semelhantes.

Figura 10: Dendrograma correlacionando os dados da tipificação molecular por PCR-Ribotipificação com os perfis de susceptibilidade a antimicrobianos de 173 S. Heidelberg isolados de carcaças de frango.

Nota: As setas indicam os isolados representantes de cada cluster utilizados nos ensaios de resistência a sanitizantes. Fonte: a autora, 2017.

Para a realização dos ensaios de determinação da resistência a sanitizantes, foi utilizada uma suspensão bacteriana composta dos cinco isolados selecionados, representando cada um dos clusters principais: P107, P119, P410, P506 e P618.

5.3 Resistência a sanitizantes

5.3.1 Método 1 – Resistência a sanitizantes, segundo Brasil, 1993, com células em suspensão

O ensaio realizado, conforme a Portaria 101/93, do MAPA, revelou que os dois sanitizantes testados, ácido peracético e quaternário de amônio, foram capazes de inativar totalmente cerca de 7 log UFC/mL do pool de S. Heidelberg, nos tempos e nas concentrações testados.

No documento Tipificação molecular e avaliação da resistência de Salmonella Heidelberg isoladas de carcaças de frango (páginas 36-45)