MÉTODOS GERAIS
6. Ensaio fenotípico com a S cerevisiae transformada
6.1. Estudo funcional das isoformas individuais da PKC de mamífero expressas pela S.
cerevisiae
O estudo da funcionalidade de cada uma das isoformas individuais da PKC expressas pelas várias estirpes de S. cerevisiae (CG378, CG379, W303-1A e X1069-1D), foi efectuado com base nos trabalhos previamente realizados com algumas das isoformas da PKC: a (Riedel et ai, 1993b; Zhu et ai, 1994; Parissenti et ai, 1996) e pi (Riedel et ai, 1993a; Parissenti et ai., 1996).
Após incubação na presença do activador da PKC, as alterações fenotípicas estudadas foram: inibição do crescimento (consequência de um aumento do tempo de duplicação celular) e alterações morfológicas das células leveduriformes.
As leveduras transformadas foram incubadas em 10 ml de meio mínimo e selectivo até
se obter uma D062o de, aproximadamente, 1. A cultura foi centrifugada a 4000 r.p.m./lO min
e as células ressuspensas em meio galactosado e selectivo. A cultura foi diluída em novo meio galactosado e selectivo, até uma DOó2o final de 0,05. Transferiu-se 1 ml de cultura para tubos
de ensaio e incubou-se a 30 °C, com agitação constante (140 r.p.m.), durante, aproximadamente, 48 h (DOó2o final de 0,5). Paralelamente, a experiência foi repetida com as
leveduras incubadas em meio mínimo e selectivo (ausência de expressão da isoforma da PKC de mamífero). A incubação das leveduras transformadas decorreu quer na presença do activador da PKC padrão, PMA (ácido araquidónico para as leveduras que expressavam a PKC-Q, quer na presença apenas do solvente, dimetilsulfóxido (DMSO; concentração final de 0,1 %). Os compostos (ou solvente) foram adicionados no início da experiência e mantidos durante toda a incubação. O efeito do activador da PKC no crescimento das leveduras foi
estudado através da determinação da D062o em espectrofotómetro (Cary IE Varian
spectrophotometer, Palo Alto, Califórnia, EUA). O crescimento obtido na presença do
activador da PKC foi expresso em percentagem do obtido apenas na presença do solvente (testado em simultâneo com o composto), foi depois transformado em percentagem de inibição do crescimento, subtraindo a 100 aquele valor.
No final da experiência, a morfologia das leveduras incubadas apenas na presença do solvente e na presença do activador da PKC foi estudada em microscópio óptico simples (Nikon Eclipse E400, Lisboa, Portugal) e fotografada (3x Zoom Digital Camera, Nikon CoolPix950, Lisboa, Portugal).
6.2. Optimização do ensaio fenotípico da S. cerevisiae transformada para a pesquisa de potenciais activadores e inibidores da PKC
O ensaio fenotípico da S. cerevisiae transformada, descrito no estudo funcional, foi optimizado com base no ensaio fenotípico das leveduras proposto para a pesquisa de inibidores da PKC (Keenan et ai., 1997a,b).
Transferiram-se 200 ul da cultura diluída em meio galactosado e selectivo (D062o final
de 0,05; ver estudo funcional) para os poços de uma microplaca (Tissue Culture Plate 96-well
Flat Bottom with Lid, Sarstedt, Lisboa, Portugal). A placa foi incubada a 30 °C, com agitação
constante (140 r.p.m.), durante 100 h (150 h nas experiências efectuadas para a obtenção das curvas de crescimento). A incubação das leveduras transformadas decorreu quer na presença do composto em estudo, quer na presença apenas do solvente (DMSO; concentração final de 0,1 %). Os compostos (ou solvente) foram adicionados no início da experiência e mantidos durante toda a incubação. O crescimento das leveduras foi monitorizado através da
determinação da D062o com um leitor de placas (Bio-Rad Benchmark Microplate Reader,
Bio-Rad, PACI, Lisboa, Portugal). Para cada ensaio foram obtidos 4 valores para o solvente e para cada concentração do composto em estudo.
A diferença entre a máxima D062o atingida e aquela medida no início da incubação foi
usada para a determinação do crescimento das leveduras. O crescimento obtido na presença do composto foi expresso em percentagem do obtido apenas na presença do solvente (testado em simultâneo com o composto), foi depois transformado em percentagem de inibição do crescimento.
Em experiências preliminares foram obtidas as curvas de crescimento para as leveduras que expressavam cada uma das isoformas individuais da PKC, para a determinação da duração das respectivas fases logarítmicas. Para a obtenção destas curvas, as leveduras foram incubadas durante 150 h, em meio galactosado e na presença apenas do solvente
simultâneo, foram traçadas as curvas de inibição do crescimento das leveduras incubadas na presença de IO"5 M do activador da PKC adequado, para a identificação do período de tempo
durante o qual a inibição máxima do crescimento foi alcançada e permaneceu constante ou apresentou alterações pouco significativas. A estimativa do efeito dos compostos baseou-se,
então, nas medições da D062o em tempos fixos, situados na fase logarítmica do crescimento
das leveduras e na fase estacionária da inibição do crescimento causada pelo activador da PKC.
Compostos activadores da PKC
O efeito dos compostos activadores da PKC foi expresso em percentagem da inibição
do crescimento causada por IO"5 M PMA (ácido araquidónico no caso da PKC-Q. Os
compostos foram testados num intervalo de concentrações de IO"13 a 10" M e , para cada um
deles, foi determinada a concentração capaz de causar 50 % da inibição do crescimento causada por IO"5 M PMA (ou ácido araquidónico para a PKC-Ç; EC50).
Compostos inibidores da PKC
Numa primeira fase foi estudado o efeito dos compostos (IO"8 - 10" M), isoladamente,
no crescimento das leveduras que expressavam cada uma das isoformas individuais da PKC. Numa segunda fase foram efectuadas experiências de interacção. Nestas experiências, ao activador da PKC, PMA (IO"8 - IO"5 M; ácido araquidónico no caso da PKC-Q foi adicionado
o inibidor da PKC. Obtiveram-se as curvas de concentração-resposta para o activador da PKC na presença e na ausência do inibidor e determinaram-se os valores de EC50 para cada um dos casos. A potência do inibidor da PKC foi calculada com base na razão dos EC50, [EC50 (activador da PKC + inibidor da PKC) / EC50 (activador da PKC)], em cada uma das isoformas da PKC testadas.