ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) PARA MEDIDA DE ANTICORPOS SÉRICOS

3.6.1 E

-OVA

A avaliação dos anticorpos específicos anti-OVA presentes no soro dos camundongos foi realizada através do método ELISA (Enzyme Linked

Immunoabsorbent Assay). Microplacas de poliestireno de 96 poços (Nunc, Roskilde,

Denmark) foram incubadas overnight a 4o_{C com 100µl de uma solução de OVA} (20µg/ml para anticorpos séricos) em tampão de cobertura (tampão carbonato pH 9,6). No dia seguinte, as microplacas foram lavadas duas vezes com salina-Tween (salina contendo 0,05% Tween-20 – SIGMA Chemical Co) e em seguida bloqueadas com 200 µl PBS-caseína (0,25% caseína diluída em PBS) e incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as placas foram lavadas novamente duas vezes em salina-Tween e incubadas com soro dos camundongos em diluição seriada de 1:100 a 1:12800 em PBS-caseína durante uma hora a 37o_{C. Como} controle positivo e negativo, foram utilizados um soro imune e um soro normal,

respectivamente. Em seguida, as placas foram lavadas seis vezes com salina- Tween e incubadas com 100µl de uma solução de anticorpo de cabra anti-IgG1, IgM ou IgA de camundongo conjugado à peroxidase (Southern Biotechnology Ass, Inc.) na diluição de 1:15000 por uma hora à 37o_{C. Em seguida, as placas foram lavadas} seis vezes com salina-Tween. A reação enzimática foi então revelada incubando-se as placas, no escuro, com 100µl de uma solução contendo 0,2 µl/ml de peróxido de hidrogênio (H2O2) e 4 mg/ml de ortofenileno-diamino (OPD) em tampão citrato (pH 5,0) até o desenvolvimento de uma coloração amarelo-escuro. Após essa etapa, as reações foram interrompidas pela adição de 20 µl/poço de uma solução de ácido sulfúrico 2N (H2SO4). A absorbância (λ = 490 nm) de cada poço foi obtida pela leitura em leitor de ELISA automático (Bio-Rad Model 450 Microplate Reader). Resultados expressos como ELISA* (ELISA-score), obtido através do somatório das densidades ópticas das 8 diluições (1/100 a 1/12800) multiplicadas por 1000. Essa forma de expressar os resultados é equivalente a mostrar curvas de titulação ou selecionar a absorbância em uma diluição particular como representativa, como já descrito em trabalhos anteriores do nosso laboratório (Carvalho, et al., 1994). Os resultados expressos nos gráficos foram obtidos pelo cálculo da média de cada grupo experimental (± erro padrão).

3.6.2 E

As placas de ELISA foram incubadas com solução (1mg/ml - 100µl/poço) contendo anticorpo de cabra anti-imunoglobulinas totais de camundongos (Southern

Biotechnology) diluídos (1:2000) em tampão carbonato pH=9,6 por, no mínimo, 18

horas a 4°C. O bloqueio foi feito aplicando-se 200µl/poço de uma solução de PBS- caseína 0,25% por uma hora à temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram lavadas com solução salina- Tween 0,05% por duas vezes. Para a dosagem de IgG1, IgM sérica o soro foi diluído 1:2000 e 1:100 para IgA sérica. Em seguida, foram feitas diluições seriadas (1:2) com o soro em PBS- caseína 0,25%, e as placas foram incubadas durante uma hora a 37°C. Anticorpos de cabra anti-IgG1, IgM ou IgA de camundongo conjugados com biotina 0,5mg/ml (Southern Biotechnology) e diluídos (1:10000) em PBS-caseína 0,25% foram adicionados aos poços (100µl/poço). As placas foram novamente incubadas por uma hora a 37°C. A seguir,

foram lavadas e adicionou-se uma solução de estreptavidina ligada à peroxidase (Sigma) diluída à 1:15000 (100µl/poço) em PBS-caseína 0,25% durante uma hora a 37°C. A reação enzimática foi então revelada incubando-se as placas, no escuro, com uma solução contendo 0,2 µl/mL de H2O2 e 4 mg/mL de ortofenileno-diamino (OPD) em tampão citrato pH 5,0 até o desenvolvimento de uma coloração amarelo- escuro. Após essa etapa, as reações foram interrompidas pela adição de 20 µL/poço de uma solução de ácido sulfúrico 2N. A absorbância (λ = 490 nm) de cada poço foi obtida pela leitura em leitor de ELISA automático (Bio-Rad Model 450 Microplate Reader).

3.6.3 E

I

E

-OVA

As placas foram incubadas com solução (50µl/poço) contendo anticorpo de rato anti-IgE de camundongos 0,5 mg/mL (Southern Biotechnology) e diluídos (1:250) em tampão carbonato (pH=9,6) por, no mínimo, 18 horas a 4°C. O bloqueio foi feito com uma solução de PBS-0,25% caseína por uma hora a temperatura ambiente (200 µl/poço). Posteriormente, as placas foram lavadas com solução salina-0,05%Tween por duas vezes. O soro dos animais (50 µL) foi incubado por 2h em temperatura ambiente. Na sequência, as placas foram novamente lavadas e realizada a incubação com Ovalbumina (OVA) biotinilada, 1µg/50µL PBS/poço, por 1h. As placas foram lavadas por seis vezes com solução salina-0,05%Tween e incubadas com peroxidase associada a estreptavidina (Sigma), 50µL/poço na concentração de 1:15000, por 1 hora. A reação enzimática foi então revelada incubando-se as placas, no escuro, com uma solução contendo 0,2 µl/ml de H2O2 e 4 mg/mL de ortofenileno-diamino (OPD) em tampão citrato (pH 5,0) até o desenvolvimento de uma coloração amarelo-escuro. Após essa etapa, as reações foram interrompidas pela adição de 20 µl/poço de uma solução de ácido sulfúrico 2N. A absorbância (λ= 490 nm) de cada poço foi obtida pela leitura em leitor de ELISA automático (Bio-Rad Model 450 Microplate Reader).

3.6.4 E

I

E

As placas foram incubadas com solução (50µl/poço) contendo anticorpo de rato anti-IgE de camundongos 0,5mg/mL (Southern Biotechnology) e diluídos (1:250) em tampão carbonato (pH=9,6) por, no mínimo, 18 horas a 4°C. O bloqueio foi feito com uma solução de PBS-0,25% caseína por uma hora a temperatura ambiente (200 µl/poço). Posteriormente, as placas foram lavadas com solução salina- 0,05%Tween por duas vezes. O soro dos animais (50 µL soro) foi incubado por 2h em temperatura ambiente. Na sequência, as placas foram novamente lavadas e realizada a incubação com anticorpo de rato anti-IgE de camundongo conjugado à biotina, 50µL/poço, por 1h. As placas foram lavadas por seis vezes com solução salina-0,05%Tween e incubadas com estreptavidina ligada a peroxidase (Sigma), 50µL/poço na concentração de 1:15000, por 1 hora. A reação enzimática foi então revelada incubando-se as placas, no escuro, com uma solução contendo 0,2 µL/mL de H2O2 e 4 mg/ml de ortofenileno-diamino (OPD) em tampão citrato (pH 5,0) até o desenvolvimento de uma coloração amarelo-escuro. Após essa etapa, as reações foram interrompidas pela adição de 20 µl/poço de uma solução de ácido sulfúrico 2N. A absorbância (λ = 490 nm) de cada reação foi obtida pela leitura em leitor de ELISA automático (Bio-Rad Model 450 Microplate Reader).