4.4.1 Avaliação da citotoxicidade sobre hemácias
O ensaio foi realizado com base em descrições da literatura (SOWEMIMO-COKER, 2002; TORRADO et al., 2008). Amostras de sangue foram coletadas de voluntários sadios e centrifugadas a 4ºC, (2500 rpm por 10 min), retirando-se o plasma e a camada de leucócitos por aspiração. Em seguida, a suspensão foi lavada com solução de NaCl 0,85% por três vezes. Glicose (1,08 mg/mL) e os antibióticos penicilina (0,3 mg/mL) e estreptomicina (0,5 mg/mL) foram adicionados a solução de NaCl tamponada que foi utilizada para acertar o volume globular para 1,0 % (JAIN et al., 2006).
As concentrações de 25 e 50 μg/mL de AFB livre (pó liofilizado), AFB deoxicolato, AFB associada à formulação de NP’s foram incubadas com a solução de eritrócitos a 37ºC, sob constante agitação (150 rpm). Controles com as mesmas concentrações de DMSO, tampão PBS pH 7,4 NaCl 0,85% e as NP’s de BSA não carregadas com AFB, também foram incubadas com a solução de eritrócitos. Em tempos pré-determinados: 1, 2, 4, 6, 12 e 24h, a agitação foi interrompida e os tubos centrifugados (1200 rpm por 5 min) para retirada do sobrenadante contendo a hemoglobina liberada pela lise dos eritrócitos.
A toxicidade dos sistemas nanoestruturados foi avaliada pela absorbância da hemoglobina verificada pelo espectrômetro de placas, operado em 540 nm (FUKUI et al., 2003). A análise foi efetuada em triplicata e os dados
foram exibidos em percentual de hemólise, calculado de acordo com a equação 4:
% Hemólise = 100 x (Absa - AbsCN) / (AbsCP - AbsCN) (4)
Onde, Absa corresponde a absorbância da amostra, AbsCN é o controle
negativo, ou seja, as hemácias incubadas somente com tampão e AbsCP é a
absorbância do controle positivo (TORRADO et al., 2008), ou seja, o que fora considerado 100% de hemólise que no estudo em questão correspondeu a amostra de AFB livre de mesma concentração da amostra em teste.
4.4.2 Atividade citotóxica sobre macrófagos J774.A1
Macrófagos de linhagem J774.A1 foram mantidos em meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium - Sigma®, St Louis, MO, USA), pH 7.6, suplementado com 10% de SFB e incubados a 37°C, em tensão de 5% de CO2. Macrófagos de linhagem J774.A1 em fase log de crescimento (72 h)
foram plaqueados em placa de 96 poços e incubados por 24 h, a 37°C e 5% de tensão de CO2. Após esse período em que as células aderiram e se
multiplicaram no poço, o sobrenadante foi retirado e foram adicionadas concentrações crescentes das substâncias (AFB-deoxi e NP´s de BSA-AFB). Os resultados foram obtidos, após 48 h de incubação nas condições citadas anteriormente, por meio da metodologia de redução do MTT (Methyl Thiazolyl Blue), (Amresco®) (3-(4,5 dimethylthiazol-2yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide). Para isso, a droga em suspensão foi retirada e os poços foram lavados com PBS Posteriormente, foi adicionado 50 µL de MTT (1 mg/mL em PBS) e incubados no escuro a 25 °C (VOLPATO et al., 2013). Após 4 h, foi adicionado 150 µL de DMSO para romper as células e solubilizar os cristais de púrpuras de formazan, provenientes do MTT metabolizado pelas enzimas mitocondriais das células viáveis, seguindo-se da leitura em espectrofotômetro (BIO-TEK Power WaveXS®) a 570 nm (MOSMANN, 1983). A média dos resultados de três experimentos independentes foram plotados em um gráfico relacionando porcentagem de células inviáveis e concentração do composto. Assim, foi possível determinar graficamente a concentração de droga capaz de
inviabilizar 50% das células aderidas (CC50) em relação ao controle. A
toxicidade sobre macrófagos J774.A1 e a atividade contra o protozoário foram comparadas através da razão denominada índice de seletividade (IS), que consiste na relação CC50 sobre J774.A1 macrófagos / IC50 sobre protozoário.
Considerou-se que valores > 1 representam maior seletividade para atividade contra o protozoário, enquanto valores < 1 expressam maior toxicidade sobre as células de mamíferos J774.A1 (TIUMAN et al., 2005).
4.4.3 Atividade antileishmania sob a forma promastigota de L. amazonensis
Para este ensaio foram utilizadas formas promastigotas obtidas de animais experimentalmente infectados com cepa de L. amazonensis.
As formas promastigotas foram obtidas e cultivadas in vitro em meio α- MEM suplementado com 10% de SFB (Soro Fetal Bovino) inativado, estreptomicina e penicilina, em estufa a 25°C. O perfil de crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis foi avaliado a partir da inoculação de 1x106 promastigotas/mL em meio de cultura α-MEM completo, e incubadas em estufa a 25°C por 7 dias. A cada 24 h de cultivo foram retiradas alíquotas das culturas e quantificadas em câmara de Neubauer, com o auxílio de microscópio ótico.
Para avaliar a atividade antipoliferativa das NP´s de AFB foi utilizado o ensaio colorimétrico por MTT que avalia a viabilidade das formas promastigotas de L. amazonensis. Para a avaliação da citotoxidade, as nanopartículas de BSA contendo AFB, as nanopartículas inertes (isentas de fármaco) e a AFB- Deoxi foram adequadamente diluídas no meio α-MEM completo, e adicionadas em placas de 24 poços. A cultura de promastigotas, foi em seguida, centrifugada, ressuspensa em α-MEM completo, quantificada em câmara de Neubauer, e ajustado o volume de células por poço (5 x 105). As células foram adicionadas aos poços contendo as amostras-teste e incubadas em estufa por 96h. Como controle negativo foram utilizados parasitas na ausência dos compostos (nanopartículas de AFB e AFB-Deoxi).
Após o período de incubação dos promastigotas com as amostras, foi adicionado 10 μL de MTT em cada poço e as placas incubadas por 4 h.
Posteriormente as placas foram centrifugadas, o sobrenadante desprezado, e adicionado DMSO para solubilizar os cristais de formazan gerados, e as placas foram então, submetidas à leitura em espectrofotômetro em 492 nm. Os resultados foram expressos em termos de porcentagem de células viáveis.
4.4.4 Efeito antileishmania sobre amastigotas intracelulares de L. amazonensis
Para este ensaio, macrófagos peritoneais foram obtidos a partir de camundongos BALB/c, com idade de 3 a 8 semanas. Seringas estéreis foram preenchidas de forma asséptica com PBS gelado, que foi injetado na cavidade peritoneal dos animais previamente eutanasiados com tiopental intravenoso. Posteriormente, com a mesma seringa, o PBS foi retirado e mantido a 4 °C. Em seguida, essa suspensão foi centrifugada durante 10 min, a 1500 rpm e a 4 °C. O pellet formado foi ressuspendido em meio RPMI 1640 (Roswell Park
Memorial Institute) e 10% de SFB de forma que cada poço contivesse 5 x 105
macrófagos/mL, que foram adicionados sobre lamínulas de vidro contidas em placas de 24 poços. As placas foram incubadas a 37°C e 5% de CO2, durante 2
h, a fim de promover a aderência dos macrófagos às lamínulas. Em seguida, as células que não aderiram foram retiradas por enxague com meio de cultura. Na sequência os macrófagos foram colocados em contato com promastigotas de L. amazonensis, com 5 a 6 dias de repique, e incubados por 4 h, a 34 °C e tensão de 5% de CO2. Após esse período, as substâncias a serem testadas
foram diluídas em RPMI suplementado com 10% de SFB, e adicionadas após lavagem dos poços para retirada dos protozoários não internalizados. As placas foram, então, incubadas por 48 h, a 34 °C e 5% de CO2. Ao fim desse
período, o sobrenadante foi retirado e as lamínulas foram fixadas em metanol por 10 min e coradas com Giemsa 10% em PBS durante 40 min. As lâminas foram montadas e analisadas em microscópio óptico por contagem do número de macrófagos total e infectados e o número de amastigotas dentro das células infectadas.
Nesse ensaio foi testada a atividade da AFB-Deoxi nas concentrações de 5, 1, 0,5 e 0,1 µg/mL e de NP´s de AFB nas concentrações 100, 50, 25, 10 e
5 µg/mL. Cada concentração foi realizada em duplicata no mesmo experimento e em dois experimentos independentes.
4.4.5 Avaliação da eficácia in vivo em animais infectados por L. amazonensis
4.4.5.1 Animais
Camundongos BALB/c machos entre 4 e 6 semanas de idade (20-25 g) foram obtidos da Universidade Estadual de Maringá (UEM-PR, Brasil). Todos os animais foram aclimatados às condições laboratoriais durante 10 dias antes do início do experimento. Os animais permaneceram nas condições de laboratório padrão num ciclo de 12 h luz/escuridão constante, com temperatura controlada (22 ± 2 ° C). Alimentos e água foram fornecidos ad libitum.
4.4.5.2 Infecção dos animais
Os animais foram inoculados por via subcutânea na pata esquerda traseira com promastigotas (1 x 107) usando agulhas de calibre de 27,5 mm com um volume de 25 µL de PBS. O desenvolvimento da lesão foi monitorado por medição semanal da espessura da almofada da pata infectada com um paquímetro digital, durante um período total de 8 semanas. Os tratamentos foram iniciados após o desenvolvimento de lesões (60 dias pós-infecção) e continuaram por 3 semanas. O tamanho da lesão foi expresso como a diferença de espessura entre a pata inoculada com o parasita e a pata contralateral do mesmo animal (DOS SANTOS et al., 2011).
4.4.5.3 Tratamento e análises histológicas
Os animais foram tratados com as nanopartículas de AFB por via intraperitoneal por 21 dias após o desenvolvimento da lesão. Os grupos foram constituídos por 6 animais e distribuídos da seguinte forma:
I. Grupo controle infectado e não tratado; II. Grupo não infectado e não tratado;
III. Grupo infectado e tratado com a droga referência Miltefosina® 100 mg/Kg/dia via oral;
IV. Grupo infectado e tratado com AFB-deoxi 2 mg/Kg/dia via intraperitoneal;
V. Grupo infectado e tratado com nanopartículas de BSA não carregadas com o fármaco AFB, 200 µL via intraperitonial;
VI. Grupo tratado com nanopartículas de BSA contendo AFB 2 mg/Kg/dia na primeira semana e 6 mg/Kg/dia nas duas semanas seguintes, via intraperitonial.
No final de um período de 21 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados através de injeção de xilazina (10 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg), via intraperitoneal e alguns órgãos selecionados (coração, rim, fígado, baço e pulmão) foram retirados e acondicionados em recipientes com solução de formol a 10%. Foram confeccionadas lâminas para análise histológica, e analisadas através da coloração por hematoxilina/eosina (HE).
4.4.5.4 Avaliação de marcadores bioquímicos
Posteriormente ao anestesiamento com xilazina e ketamina, amostras de sangue foram coletadas via punção cardíaca para dosagem de creatinina, uréia, AST, ALT e GGT. O sangue coletado foi acondicionado em tubos de ensaio com heparina para obtenção do plasma. As análises foram realizadas através do método colorimétrico em espectrofotômetro de placa (Spectramax 190®).