RESULTADOS E DISCUSSÃO
EDC GEL 2331 ± 414 1628 ±
5.2.6. ENSAIOS BIOLÓGICOS
5.2.6.1. CITOTOXICIDADE E ADESÃO CELULAR USANDO CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE RATO (RMSC)
Diante da baixa estabilidade física dos filmes não-modificados quando em solução aquosa, os experimentos biológicos foram realizados somente com os filmes modificados por EDC.O pré- requisito inicial para que os filmes GG possuam aplicação biológica é que não induzam citotoxicidade. O teste de citotoxicidade foi conduzido de acordo com a ISO 10993-5:2009: para um biomaterial ser considerado citotóxico, a taxa de atividade metabólica não pode ser inferior a 70% em relação ao controle negativo. As células L929 foram colocadas em contato direto com os filmes GEL/EDC, GALFLAM/EDC, GG/EDC 0.1, GG/EDC 0.3 e GG/EDC 0.5
95 durante 24 h e 48 h. A análise conduzida usando a linhagem celular L929 não apresentou citotoxicidade dos filmes, independente da concentração de galactomanana nos filmes (figura 30). 24 h 48 h 0 25 50 75 100 125
GEL/EDC
GG 0,1/EDC
GG 0,3/EDC
GG 0.5/EDC
GAL
FLAM/EDC
L929
A
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Figura 30. Citotoxicidade dos filmes GEL/EDC, GALFLAM/EDC, GG 0,1/EDC, GG 0,3/EDC e
GG 0,5/EDC representadas em relação ao controle negativo. Nenhum filme provocou diminuição da atividade metabólica inferior a 70% (eixo ‘y’, valor tracejado) quando em contato direto com as células L929.
De acordo com a Sociedade Internacional para Terapia Celular, as MSC devem: (i) aderir à cultura em plástico; (ii) diferenciar em ao menos 3 diferentes linhagens celulares; e (iii) expressar marcadores específicos da superfície (dependendo da origem do tecido e da espécie). Os resultados obtidos mostraram que as rMSC aderiram ao plástico, apresentaram marcadores de superfície típicos das rMSC, e foram capazes de se diferenciar em linhagens osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas, conforme revelado pela diferenciação. A caracterização das rMSC pode ser visualizada na figura 31.
A taxa de adesão celular aos filmes foi de aproximadamente 100 %, independentemente das composições dos biomateriais, e não foi significativamente diferente entre os grupos: GEL/EDC: 99.89 % ±0.144; GALFLAM/EDC: 100 % ±0,006; GG/EDC 0,1: 99.98 % ±0.017;
GG/EDC 0,3: 100 % ±0.005; GG/EDC 0,5: 100 % ±0,006 (figura 32).
Devido à natureza hidrofílica e a estrutura densa dos filmes de gelatina/galactomanana, esses biomateriais apresentam uma potencial aplicação como curativos para pele. Nesse contexto, os filmes GG devem ser capazes de prevenir a perda de água do tecido, oferecer proteção física contra os danos relacionados ao ambiente, e atuarem como suporte para adesão celular.
96 Figura 31. Caracterização das Células-tronco mesenquimais de rato (rMSC). De acordo com a Sociedade Internacional para Terapia Celular, MSC devem (A) aderir ao plástico; diferenciar em diferentes linhagens: (B) adipogênica, (C) condrogênica e (D) osteogênica. (As barras representam 100 μm); e apresentar imunofenotipagem: (E) rMSC foram negativas para CD11b e CD45, e positivas para CD29 e CD44. As reações controle estão representadas pelas linhas pretas, e as incubações com anticorpo, pela linha cinza.
97 Figura 32. Percentual de rMSC aderidas sobre os filmes GEL/EDC, GALFLAM/EDC, GG/EDC
0.1, GG/EDC 0.3 e GG/EDC 0.5. Todas as amostras apresentaram taxa de adesão similar e próximas a 100%.
5.2.7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste estudo, novos filmes compostos de gelatina e galactomanana foram produzidos e caracterizados quanto a composição química, comportamento de intumescimento em solução aquosa, morfologia, estabilidade térmica, propriedades mecânicas e análises biológicas, como parte dos pré-requisitos para uma potencial aplicação dos mesmos como scaffolds para engenharia tecidual.
A fim de prevenir a solubilidade dos filmes em meio aquoso, os mesmos foram reticulados com cloreto de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC). Os filmes modificados intumesceram entre 300 % e 900 %, resistiram à dissolução em meio aquoso e apresentaram propriedades mecânicas superiores aos filmes não modificados. As propriedades físico-mecânicas de todos os filmes modificados levam a classificá-los como filmes-hidrogéis, uma vez que são polímeros hidrofílicos reticulados que apresentam elevado grau de intumescimento em meio aquoso e, após secagem, apresentam sua morfologia de sólido intacta, sendo capazes de intumescerem novamente.
98 Através da técnica de espectroscopia na região do infravermelho (FTIR-ATR) foi possível identificar que a reação de reticulação mediada por EDC gerou novas ligações éter na estrutura da galactomanana, o que provavelmente está associado a um aumento na elasticidade dos filmes contendo o polissacarídeo. Além disso, o emprego de EDC e galactomanana associados à gelatina na mesma composição, deu origem a biomateriais com propriedades mecânicas superiores àquelas dos filmes de gelatina.
Devido ao fato da galactomanana ser uma macromolécula ramificada com tendência a permanecer emaranhada 220, ela poderia estar localizada entre as cadeias de gelatina reticuladas
e contribuir para o aumento de volume livre quando submetida a um estímulo externo (p. ex. tração ou intumescimento com soluções aquosas), atuando como um agente de elasticidade. Diante da hipótese, é proposto um modelo de interação entre os sistemas GEL/ GALFLAM /EDC
(figura 33).
Figura 33. Ilustração do modelo proposto de cadeias emaranhadas e efeito elástico da galactomanana.
Os ensaios de contato celular usando a linhagem L929 confirmaram que os filmes reticulados não são citotóxicos. Além disso, todos os filmes apresentaram excelente capacidade de suporte à adesão de rMSC.
99
5.3. FILMES DE GALACTOMANANA/POLI (ÁCIDO ACRÍLICO)
OBTIDOS POR CASTING
Nesta seção estão apresentados e discutidos os resultados de caracterização de filmes compostos por galactomanana LBG (GALLBG) e poli (ácido acrílico) (PAA). Tendo em vista as
características estruturais do PAA e da GALLBG, e os conceitos envolvidos nas possíveis
interações entre eles, os resultados a seguir descrevem a caracterização de filmes GALLBG/PAA,
e sua potencialidade para serem usados em engenharia tecidual.
A GALLBG foi reticulada com ácido 1,2,3,4-butano tetracarboxílico (BTCA) e associada
ao poli (ácido acrílico) (PAA) através da produção de blendas que, posteriormente, foram obtidas na forma de filmes produzidos pela técnica da casting. Os filmes GALLBG/PAA foram
preparados em dois grupos distintos: filmes reticulados com BTCA (nomenclatura contendo “BTCA” no final), e filmes reticulados com BTCA contendo Tween 80 (nomenclatura contendo “BTTW” no final).
Foram avaliados, principalmente, os efeitos da reticulação sobre a galactomanana, da incorporação de PAA e de Tween 80 sobre as características química, de intumescimento, morfológicas, mecânicas, molhabilidade e citotoxicidade dos filmes.
5.3.1. ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO COM