Ensaios colorimétricos de viabilidade celular

Após sua purificação e caracterização, o inibidor de tripsina de sementes de Juquiri (ITJ) foi avaliado quanto à capacidade de induzir morte celular em linhagens de células tumorais in vitro. Uma varredura com as linhagens celulares tumorais HeLa, HepG2 e B16-F10, além de células não transformadas 3T3 e Raec, foi realizada com intuito de avaliar a toxicidade induzida pela incubação com ITJ. Após este procedimento, foi possível observar que ITJ atua de maneira tóxica e específica para uma determinada linhagem de células tumorais, a B16-F10, uma linhagem de melanoma de camundongo, não apresentando toxicidade quando incubado juntamente com linhagens de células normais, como hemácias, células fibroblásticas (3T3) e células endoteliais (Raec).

5.4.1.1. Avaliação da atividade hemolítica e da citotoxicidade de ITJ sobre linhagens de células não transformadas (3T3 e Raec)

A toxicidade de ITJ isolado foi avaliada contra eritrócitos humanos, nas concentrações de 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 µM, através do ensaio de atividade hemolítica. ITJ não apresentou toxicidade contra as células do sangue humano quando avaliadas em ensaio colorimétrico, analisado em espectrofotômetro a 405 nm (Figura 21). Resultados semelhantes foram encontrados para os inibidores de tripsina de Coccinia grandis (SATHEESH, L.S.; MURUGAN, K. 2010), EvTI purificado a partir de sementes de Erythrina velutina (MACHADO, R.J.A. et al., 2013) e xb-KTI de Xanthosoma blandum (LIMA, T. B. et al., 2011), indicando uma baixa toxicidade destes inibidores contra células do sangue periférico humano, o que é bastante promissor quando se pensa na utilização de ITJ como uma forma de tratamento adjuvante contra melanoma, porém estudos adicionais, incluindo estudos de mutagênese e alergenicidade, dentre outros, são necessários para confirmar a segurança do uso deste inibidor como agente farmacológico.

Figura 21 - Avaliação da atividade hemolítica de ITJ.

ITJ foi testado nas concentrações de 0,1-2,5 µM; Triton-x 100 a 1% foi utilizado como controle positivo (100% de hemólise), enquanto a solução salina a 0,9% foi utilizada como controle negativo (sem hemólise) do experimento. (*) P < 0,001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n = 3) quando comparados ao controle positivo.

A viabilidade de células 3T3 foi analisada após incubação por 72 horas com concentrações crescentes de ITJ (0,003 a 1 μM), através do ensaio de MTT (MOSMANN, T.; 1983). Após este período foi possível observar que ITJ não apresentou toxicidade em nenhuma das concentrações testadas em fibroblastos de camundongo (Figura 22). Resultados semelhantes utilizando a mesma linhagem celular foram observados com o inibidor do tipo Kunitz purificado de sementes de E. contortisiliquum (PAULA, C. A. et al., 2012).

Além de avaliar a ação do inibidor contra células 3T3, outro ensaio de viabilidade celular foi realizado através do teste Alamar Blue, utilizando a linhagem de células endoteliais derivadas de aorta de coelho (RAEC), em que ITJ foi aplicado nas concentrações de 0,325 µM, 0,65 µM e 1,3 µM, que corresponde à metade da IC50, à IC50 e o dobro da IC50, respectivamente (Figura 23). A viabilidade das células endoteliais não foi afetada pela incubação de ITJ nas concentrações testadas. Outros inibidores do tipo Kunitz apresentaram resultados semelhantes quando testados contra linhagens de células endoteliais, como o inibidor PIVL (MORJEN, M. et al., 2014), que não apresentou toxicidade após 72 horas de incubação em células HMEC-1 (linhagem celular de endotélio microvascular dérmico humano – ATCC® CRL-3243™) com várias concentrações diferentes (0-1000 nM); e o inibidor BmTI-A,

purificado do carrapato Rhipicephalus microplus, que também não apresentou toxicidade contra células HUVEC (linhagem celular umbilical endotelial humana - ATCC® CRL -1730™) após 24 horas de exposição, nas concentrações de 0,1 µM - 10 µM (SOARES, T. S. et al., 2016).

Figura 22 - Avaliação da citotoxicidade de ITJ contra linhagem de fibroblastos murinos.

ITJ testado nas concentrações de 0,003-1 µM; Células sem a presença do inibidor foram utilizadas como controle negativo do experimento. (*) P < 0,001. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n = 3) quando comparados ao controle (sem tratamento).

Estes resultados são importantes, já que muitos dos agentes quimioterápicos tradicionais exibem toxicidade severa contra células normais, causando efeitos colaterais indesejáveis e dessa forma limitando sua aplicação no campo clínico. Além disso, muitos dos agentes terapêuticos administrados na prática clínica ou não conduzem à cura ou possibilitam a sobrevivência, em longo prazo, de muitos tipos de câncer, o que provavelmente permite o desenvolvimento de mecanismos de resistência pelas células tumorais à doença. Por essa razão, fica clara a necessidade de novos agentes com diferentes mecanismos de ação que possam ser utilizados no tratamento direto dessas doenças e/ou como adjuvantes no aperfeiçoamento da terapia do câncer (CRAGG et al., 2006; REN, 2005).

Figura 23 - Avaliação da viabilidade celular de RAEC após incubação com ITJ.

Células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) foram expostas ao ITJ nas concentrações de 0,325, 0,65 e 1,3 µM, e avaliada a viabilidade celular por Alamar Blue nos tempos de: A) 24 horas; B) 48 horas e C) 72 horas de exposição.

5.4.1.2. Avaliação da toxicidade de ITJ sobre linhagens de células tumorais

O inibidor ITJ foi avaliado pelo ensaio de MTT (MOSMANN, T.) contra células tumorais HeLa (adenocarcinoma cervical humano, ATCC CCL-2TM), HepG2 (Hepatoma humano ATCC HB-8065TM) e B16-F10 (melanoma derivado de camundongo CRL-6475TM), apresentando toxicidade apenas contra células de melanoma, com um IC50 de 0,65 µM (Figura 24).

Figura 24 - Avaliação da citotoxicidade de ITJ contra células B16-F10.

Células de melanoma de camundongo (B16-F10) foram expostas por diferentes tempos (24, 48 e 72 horas) ao ITJ e avaliadas pelo ensaio de MTT.

Este resultado mostra que ITJ é muito superior em toxicidade quando comparado a outros inibidores purificados de sementes de leguminosas, como por exemplo, os inibidores de quimotripsina de Acacia confusa (LAM, Ng; 2010) e o de tripsina purificado de sementes de Vigna unguiculata, denominado BTCI (JOANITTI, G.A.; AZEVEDO, R. B.; FREITAS, S. M.; 2010), que foram citotóxicos contra células tumorais MCF-7 com um IC50 de 10,7 ± 4,2 µM e 200 µM, respectivamente; o inibidor de tripsina purificado de sementes de Nephelium lappaceum (FANG, E.F.; NG,T.B.,2015), que apresentou toxicidade frente a uma variedade de linhagens tumorais, como MCF-7 (IC50 = 130,7 µM), HepG2 (IC50 = 215,3 µM ) CNE-1 (IC50 = 277,0 µM) e CNE-2 (IC50 = 30,0 µM); e o inibidor de tripsina purificado de um cultivar de Phaseolus vulgaris (CHAN, Y.S. et al.; 2014) que apresentou toxicidade contra células MCF-7 e HepG2 numa concentração de 125 µM.

Devido à alta incidência de melanoma na população brasileira, a toxicidade específica de ITJ sobre este tipo de células e a redução significativa da proliferação celular, a linhagem B16F10 foi utilizada para ensaios posteriores.

5.4.2. Efeito de ITJ na proliferação de células de melanoma (B16-F10)