Ensaios comportamentais com animais

4.10.1. Animais

O manejo dos animais ocorreu de acordo com as normas de práticas didático- científicas e com aprovação prévia do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Tiradentes – UNIT, nº 070209, aprovado em 06/05/2009 (Anexo 3).

43 Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos, com peso entre 25-30 g e ratos machos Wistar, com peso entre 200-230 g, cedidos pelo Biotério da UNIT e acomodados em gaiolas pequenas (n=6). Os mesmos foram mantidos com água e alimento ad libitum, sendo submetidos a jejum alimentar por 4 a 6 horas antes da realização dos experimentos. Após cada ensaio farmacológico, os animais foram sacrificados por administração de tiopenal sódico e acondicionados em freezer para posterior descarte. Entretanto, os animais submetidos aos testes de campo aberto e labirinto em cruz elevado, foram sacrificados por deslocamento cervical, com intuito de retirar o cérebro para posterior utilização na avaliação imunohistoquímica, como uma tentativa de identificar as áreas de afinidade do extrato em questão.

4.10.2. Preparação das amostras

O extrato etanólico de P. sagittalis e respectivas frações foram diluídos em água destilada com 5% de DMSO (v/v), e administrados aos animais dos grupos experimentais, as concentrações utilizadas do extrato foram baseadas nos trabalhos de Rodrigues (2007) e Barros et al. (2006) que realizaram estudos com os extratos aquoso e etanólico desta planta, respectivamente. Os animais do grupo controle receberam água destilada com 5% de DMSO (v/v) (veículo). Os animais do grupo padrão receberam diazepan, sendo a concentração variável a depender do protocolo experimental.

4.10.3. “Screening” farmacológica comportamental (CARLINI, 1972)

Esse teste foi realizado como pré-teste, a fim de avaliar o perfil farmacológico do extrato etanólico de P. sagittalis e suas respectivas frações. Foram utilizados 5 grupos, com 3 animais cada. Os animais dos grupos 1, 2, 3 e 4, receberam, respectivamente, a administração de 100 mg/mL do extrato etanólico bruto das folhas

44 de P. sagittalis e as frações aquosa, etanólica e acetônica, respectivamente, e o grupo controle recebeu o veículo todos por via intra-peritoneal (i.p.). O comportamento dos animais de cada grupo foi monitorado durante o período de 4 horas e enquadrado em categorias que estão descritas no Anexo 4. Após esse período, os animais foram mantidos com água e ração ad libitum, observados após 24 horas e sacrificados ao término de 14 dias.

Na triagem farmacológica foram observados os parâmetros de alterações comportamentais de efeitos estimulantes como: hiperatividade, irritabilidade, agressividade, tremores, convulsões, auto-limpeza e piloereção; de efeitos depressores como: hipnose, ptose palpebral, sedação, anestesia, resposta diminuída ao toque, reflexo auricular e força ao agarrar; bem como de efeitos autossômicos: tipo de fezes, respiração forçada, micção excessiva, entre outros. Comparando-se os grupos experimentais com o controle.

4.10.4. Teste de Campo Aberto (TABARELLI et. al., 2004)

Para realização do teste de campo aberto, os animais foram utilizados em grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por via oral (p.o.), nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos da administração dessas substâncias, os animais foram colocados no centro do campo aberto quadrado de 72x72 cm (Figura 2), dividido internamente em 16 quadrantes iguais, no qual os animais permaneceram por 5 minutos. Foram computados o tempo de movimentação dos animais, o número de auto-limpeza e o número de quadrantes percorridos. Como droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (5 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle. A observação da ambulação dos animais permite não só a avaliação da atividade motora, quando associada ao número de auto-limpeza, como também torna possível a identificação dos sinais de ansiedade.

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Figura 2 – Aparelho de campo aberto “Open Field”. Fonte: brc.riken.jp

4.10.5. Teste de Rota Rod (OLIVEIRA et al., 2008)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos com (n=6), os quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Os animais foram submetidos ao treino na barra giratória 24 horas antes do experimento e 30 minutos após a administração das substâncias (v.o.), sendo avaliados o número de quedas e o tempo de permanência na barra giratória (Figura 3). O número máximo de quedas permitido foi de 3, sendo que, após a terceira queda, o animal não mais era reconduzido ao rota-rod. O tempo máximo de permanência permitido no rota-rod foi de 3 minutos. Como droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (2 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle. O comprometimento motor é observado por menor tempo de permanência dos animais no aparelho.

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Figura 3 – Aparelho de Rotarod. Fonte: tmc.sinica.edu.tw

4.10.6. Teste de Tempo de Sono Induzido por barbitúrico (CARLINI, BURGOS, 1979)

Esse modelo apresenta duas etapas distintas de observação após a aplicação do tiopental: o tempo de latência e o tempo de duração do sono. Os animais foram separados em grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos, receberam a administração do tiopental sódico ABBOTT (40 mg/Kg) via i.p., e observou-se o tempo de latência e duração do sono. O tempo máximo de sono considerado foi 120 minutos. Como droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (5 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle.

4.10.7. Teste de Labirinto em Cruz Elevado (BLATT; TAKAHASHI, 1999)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos da administração das substâncias os animais foram colocados no aparato com braços abertos e fechados, medindo 1 m de comprimento, 10 cm de largura e 50 cm de altura (Figura 4). Os animais

47 permaneceram no aparelho por 5 min., sendo computados o tempo de movimentação do animal e o número de vezes que eles entram em cada braço. Como droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (2 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle.

Nesse teste, o aumento no número de entradas e no tempo de permanência dos animais nos braços abertos, em comparação ao grupo controle, corresponde a parâmetros indicadores da redução da ansiedade dos animais.

Figura 4 – Aparelho do teste de labirinto em cruz elevado. Fonte: jsw.lifesciences.com

4.10.8. Teste anticonvulsivante induzido por Pentilenotetrazol (LÖSCHER; SCHIMIDT, 1988)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos, receberam pentilenotetrazol (PTZ) SIGMA (60 mg/Kg) via i.p., e foram observados os tempos de latência para o início das convulsões e de morte dos animais. Como controle será utilizado Diazepan Cristalia (3 mg/Kg). Os animais foram observados por 20 minutos, para a determinação do número de convulsões, do tempo de duração das convulsões e do número de animais mortos. Considera-se que, uma substância ansiolítica, com ação via sistema

48 GABAérbico, está associada a um efeito protetor, em animais submetidos à convulsão induzida pelo PTZ.