Tendo-se efectuado os vários ensaios de cristalização indicados na secção de Material e Métodos, na Tabela 4.6 encontram-se as condições nas quais se obtiveram melhores cristais que partilham a concentração de proteína (60 mg/ml) e a temperatura de cristalização (20 ºC).
Tabela 4.6 – Condições, tipo de gota e temperatura de cristalização empregues na obtenção de cristais de hemoglobina
Concentração e tampão da
Hemoglobina Condições de cristalização Tipo de gota
Temperatura de cristalização 60 mg/ml Tampão Tris-HCl 20 mM (pH=8.2) 20% PEG 4K/ 0.2 M NH4Cl
(poço e gota) Gota suspensa 2+2
20 ºC 10% PEG 4K/ 0.2 M NH4Cl
(poço e gota) Gota suspensa 2+2 20% PEG 4K/ 0.2 M NH4I proteína ao poço (700 μl) Adição de 4 μl de
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Salienta-se o facto de tanto o cloreto de amónio (NH4Cl) como o iodeto de amónio (NH4I)
originarem cristais de hemoglobina. Todavia, é preferível evitar o uso de NH4I já que exibe um sinal
anómalo que, aquando do tratamento dos dados, se pode confundir com o sinal anómalo gerado pelos metais de transição dos ALFs.
Por outro lado, paralelamente aos ensaios de gota suspensa (hanging drop) com 2 μl de proteína e 2 μl de solução precipitante (Figura 4.14), efectuaram-se de igual modo ensaios em que, substituindo as gotas, se adicionou directamente a hemoglobina (3,4,5 ou 6 μl) no poço com a solução precipitante (500 ou 700 μl). O recurso a esta metodologia deveu-se ao facto de muitos dos cristais obtidos por gota suspensa apresentarem grandes dimensões obrigando a que sejam partidos o que, embora torne possível a prossecução dos estudos, pode ter reflexos na qualidade da sua difracção: a adição da proteína ao poço permitiu a obtenção de cristais únicos e de tamanho adequado às experiências de difracção (Figura 4.15). Independentemente da técnica de obtenção, os cristais (facilmente reconhecíveis pela coloração vermelha) cresceram até valores compreendidos entre 0.05 e 0.2 mm num espaço temporal de 48 horas após o qual se procedeu ao soaking com vários compostos de modo a conseguir-se a sua incorporação nos cristais de hemoglobina (com uma concentração de cerca de 20 mM) conforme indicado na Tabela 4.7.
Prolongou-se o soaking durante 24 horas ao fim das quais se observaram as gotas verificando- -se a sobrevivência dos cristais e a dissolução dos vários compostos (adicionados aos poços) o que parece apontar para o sucesso do soaking.
Assim, foi possível passar à recolha e congelamento em azoto líquido dos melhores cristais com os diferentes compostos para posterior análise por radiação de Sincrotrão no ESRF e no Soleil usando paratona como solução crio-protectora.
Figura 4.15 – Cristais de hemoglobina obtidos pela adição de 5 μl de proteína no poço com 700 μl de solução precipitante
Cristais obtidos com 20% PEG 4K/ 0.2 M NH4Cl e com
um tamanho de, aproximadamente, 0.1 mm
Figura 4.14 – Cristais de hemoglobina obtidos nos ensaios de gota suspensa
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Tabela 4.7 – Resumo das condições e resultados de difracção dos cristais de hemoglobina analisados por radiação de Sincrotrão (ESRF e Soleil)
Em todas as condições, a concentração de hemoglobina é igual a 60 mg/ml (em tampão Tris-HCl 20 mM, pH=8.2) e os compostos possuem uma concentração de 20 mM
Informações sobre o soaking
Condições de
cristalização Tipo de gota
Linha de
Sincrotrão Resultado de difracção
ALF 186 Adição de 0.5 μl à gota 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl Gota suspensa 2+2 ID 23-1 ESRF Resolução de 2.4 Å 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl Gota suspensa 2+2 ID 23-1 ESRF Resolução de 1.9 Å ALF 475 Adição de 2.8 mg no poço com 700 μl 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 6 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína no
poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3.4 Å ALF 486 Adição de 2.7 mg no poço 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3 Å
ALF 487 Adição de 2.6 mg no poço 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Má difracção 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3.1 Å
ALF 554 Adição de 1.9 mg no poço 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 2 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 2 Å 20% PEG 4K
0.2 MNH4Cl
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 1.9 Å ALF 794 Adição de 2.2 mg no poço 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Não difractou 20% PEG 4K
0.2 M NH4I
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Não difractou ALF 794 Adição de 0.5 μl à gota 20% PEG 4K 0.2 MNH4Cl Gota suspensa 2+2 ID 14-1 ESRF Resolução de 2 Å 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl Gota suspensa 2+2 ID 14-1 ESRF Resolução de 1.8 Å ALF 850 Adição de 1.8 mg no poço 20% PEG 4K 0.2 M NH4I 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 2 Å 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl 4 μl proteína em 700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3.1 Å 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl 4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 3.2 Å 20% PEG 4K
0.2 M NH4Cl
4 μl proteína em
700 μl no poço ID 14-1 ESRF Resolução de 2.4 Å ALF 850 Adição de 0.5 μl à gota 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl Gota suspensa 2+2 ID 14-1 ESRF Resolução de 2 Å 20% PEG 4K 0.2 M NH4Cl Gota suspensa
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Na Tabela 4.7, encontram-se resumidas as condições observadas para os cristais analisados podendo-se verificar que os resultados de difracção variam desde a sua inexistência até à difracção a altas resoluções.
Conseguiram-se obter resultados interessantes com o ALF 554 que, no entanto, tal como com a lisozima, não podem ser divulgados por questões de propriedade intelectual. Assim sendo, optou-se por processar os dados relativos ao cristal de hemoglobina com o ALF 850 (Soleil) apresentando-se nos sub-capítulos seguintes os passos necessários para a resolução da estrutura tridimensional do complexo.