Os ensaios de cristalização com os compostos de vanádio foram conduzidos utilizando as proteínas HEWL e tripsina.
Compostos de vanádio com a proteína HEWL
A HEWL foi adquirida à Sigma-Aldrich, enquanto os compostos de vanádio foram preparados no laboratório do Prof. João da Costa Pessoa, IST-UL. Os aminoácidos arginina e prolina foram adquiridos à Sigma-Aldrich e Fluka, respetivamente. As cristalizações foram realizadas em caixas de cristalização de 24 poços da Molecular Dimensions utilizando lamelas silinizadas. O tampão acetato de sódio (NaCH3COO) e o glicerol usado na solução crio-protetora foram adquiridos à Sigma-Aldrich, e o cloreto de sódio (NaCl) à Scharlay. Os cristais foram visualizados no microscópio SteREO Discovery.V12, da Zeiss.
Nos ensaios de otimização dos cristais usou-se como solução precipitante 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 4,5, variando o NaCl entre 2 a 10%. Preparou-se uma solução de HEWL a 50 mg/mL, dissolvendo-a em 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 4,5. Efetuaram-se ensaios de gota suspensa, através do método de difusão de vapor, com 700 μL de solução precipitante no reservatório e gotas de 2 μL de proteína e 2 μL de solução precipitante, a uma temperatura de 20ºC.
De seguida foram preparadas as várias soluções de compostos de vanádio no estado de oxidação V(IV) (sulfato de vanadilo (VOSO4)) na presença dos ligandos Hpic, arginina e prolina com o intuito de produzir complexos do tipo VO(ligando)2. Para tal, o vanádio e o ligando desejado foram dissolvidos na solução estabilizadora da proteína (Harvesting Buffer, contendo 0,1 M de tampão acetato de sódio a pH 4,5, e 12% de cloreto de sódio), para serem usados nas experiências de soaking. Os compostos de vanádio foram preparados de modo a estarem numa concentração de 10 mM; 5 M e 2,5 mM, encontrando-se os compostos V(IV):ligando numa estequiometria de 1:2. Realizou-se o soaking, transferindo-se cerca de 5/6 cristais de HEWL para uma gota de 5 μL de cada composto, nas mesmas condições que as indicadas para obtenção dos cristais de HEWL descritas acima.
Os melhores cristais foram transferidos para a solução crio-protetora (solução estabilizadora da proteína, com a adição de 30% glicerol), e congelados em azoto liquido.
Os cristais congelados foram analisados por radiação de Sincrotrão nas linhas ID ID29 do ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) (Grenoble, França) e Proxima I do Soleil (Paris, França). Os dados de difração dos cristais foram indexados no programa XDS (Kabsch 2010), e processados com o programa AIMLESS, presente no conjunto de programas CCP4 (Collaborative Computational
42 Compostos de vanádio com a proteína tripsina
A tripsina de pâncreas bovino foi adquirida à Sigma-Aldrich. O reagente sulfato de amónio ((NH4)2SO4) foi adquirido à Panreac, e os reagentes cacodilato de sódio, HEPES, cloreto de cálcio (CaCl2), PEG 8000 e PEG3350 adquiridos à Sigma-Aldrich.
A otimização dos cristais de tripsina foi levada a cabo dissolvendo a tripsina, nas concentrações 60 mg/mL e 30 mg/mL, em 25 mM de tampão HEPES a pH 7,5, e 10 mM de CaCl2, quer na presença de 10 mg/mL do inibidor benzamidina, quer na sua ausência. Utilizaram-se as condições 15, 20, 30 e 31 do screen de cristalização Crystal Screen HT da Hampton Research, por serem condições que originam os melhores resultados (Tabela 3.1), recorrendo a ensaios de gota suspensa, através do método de difusão de vapor, com 700 μL de solução precipitante no reservatório e gotas de 2 μL de proteína e 2 μL de solução precipitante, a uma temperatura de 20ºC.
Tabela 3.1 – Condições de cristalização, e respetivas soluções estabilizadoras (Harvesting Buffer), testadas para a tripsina, provenientes do do screen de cristalização Crystal Screen HT da Hampton Research.
Condição Sal Tampão Precipitante Agente
Agente Precipitante na solução estabilizadora 15 0,2 M sulfato de amónio 0,1 M cacodilato de sódio pH 6,5 PEG 8000, 30% PEG 8000, 35% 20 0,2 M sulfato de amónio 0,1 M acetato de sódio pH 4,6 PEG 3350, 25% PEG 3350, 30% 30 0,2 M sulfato de amónio – PEG 8000, 30% PEG 8000, 35% 31 0,2 M sulfato de amónio – PEG 3350, 30% PEG 3350, 35% Procedeu-se então aos ensaios de co-cristalização da proteína nas mesmas concentrações, e no mesmo tampão, tanto na ausência como presença da benzamidina, incubada durante 1 hora com os compostos de V(IV), VO(pic)2, VO(dipic)2, VO(maltol)2, VO(dhp)2 e V(V) (metavanadato de sódio (NaVO3)), bem como ensaios de co-cristalização e soaking para a proteína apenas na concentração de 30 mg/mL, na ausência de benzamidina, incubada durante 1 hora com os compostos deVO(pic)2 com arginina, VO(pic)2 com prolina e V(IV) com prolina.
Nos ensaios de co-cristalização, o V(IV) de cada um dos compostos encontrava-se a uma concentração de 10 mM, com os compostos V(IV):ligando numa estequiometria de 1:2.
Os ensaios de soaking foram realizados através da transferência de 5/6 cristais de tripsina sem benzamidina para uma gota de 5 μl de cada um dos compostos dissolvidos em soluções estabilizadoras de cada uma das condições (Tabela 3.1), com o V(IV) a uma concentração de 10 mM, e sucessivas diluições para concentrações de 5 mM e 2,5 mM, encontrando-se os compostos V(IV):ligando numa estequiometria de 1:2.
Os melhores cristais foram então recolhidos e congelados em azoto líquido, utilizando uma solução crio-protetora (solução estabilizadora de cada condição, discriminadas na Tabela 3.1, com a adição de 30% glicerol).
43 Os cristais congelados foram analisados por radiação de Sincrotrão nas linhas ID29 do ESRF (Grenoble, França) e Proxima I do Soleil (Paris, França).
Os dados de difração dos cristais foram indexados no programa XDS (Kabsch 2010), e processados com o programa AIMLESS presente no conjunto de programas CCP4 (Dodson 1987).
Para o cristal de tripsina com o composto VO(pic)2, utilizou-se o programa PHASER (McCoy et al. 2007) para determinar as fases através do método de Substituição Molecular, utilizando como modelo a estrutura depositada no PDB, com o código 1S0Q. O refinamento da estrutura foi conseguido utilizando o programa REFMAC5 (Murshudov et al. 2011), intercalado com a visualização e ajuste do modelo molecular no programa COOT (Crystallographic Object-Oriented Toolkit) (Emsley & Cowtan 2004). Os mapas de densidade anómala foram gerados a partir dos programas CAD e FFT (Read & Schierbeek 1988), e por fim as figuras foram geradas através do programa Pymol (DeLano 2002).