A necessidade de estabelecer métodos simples, rápidos e capazes de detectar e caracterizar a presença de desreguladores endócrinos no meio ambiente (PASSOS et al., 2009) e/ou fitoestrógenos que podem ser uma alternativa à terapia hormonal pós- menopausa (KURZER, 2003), tem levado ao desenvolvimento de um grande número de ensaios in vitro e in vivo (PASSOS et al., 2009).
Os ensaios in vivo são amplamente utilizados, porém, eles não são adequados para screening em larga escala e suas vantagens ainda são limitadas pela sensibilidade relativamente baixa, alto custo e desenvolvimento experimental demorado em comparação com os ensaios in vitro (ZACHAREWSKI, 1997; CÉSPEDES et al., 2004), como por exemplo, o ensaio uterotrófico em roedores. Esse ensaio avalia a proliferação do tecido uterino em resposta aos estrógenos, é um ensaio confiável, mas inviável, exatamente devido às desvantagens citadas com relação aos ensaios in vivo (VILLALOBOS et al., 1995; PAYNE et al., 2000). Sendo assim, uma bateria de testes in vitro vem sendo proposta (PAYNE et al., 2000). Os bioensaios in vitro, principalmente aqueles baseados nos mecanismos de ação dos estrógenos, estão se tornando cada vez mais importante para identificar e avaliar os estrógenos ambientais. Eles são meios eficazes e eficientes de avaliação rápida da estrogenicidade de um grande número de amostras ambientais e compostos, minimizando o uso de animais de laboratório (ZACHAREWSKI, 1997; CÉSPEDES et al., 2004).
A maioria desses ensaios in vitro está classificada dentro de uma das três categorias: a) ensaios de ligação competitiva ao RE, que verificam a afinidade de ligação de um composto químico ao RE; b) ensaios de informação gênica, que determinam se a transcrição e tradução gênica são dependentes da interação do RE com seu ligante; e c) ensaios de proliferação celular, que avaliam o aumento do número de células alvo, durante a fase exponencial de proliferação. Assim, esses ensaios atuam em diferentes níveis de complexidade biológica na resposta celular aos estrógenos (FANG et al., 2000).
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Predominantemente baseado em linhagens celulares derivadas de humanos, as técnicas de proliferação utilizam parâmetros que avaliam a multiplicação celular induzida pela exposição a compostos estrogênicos. As linhagens celulares comumente usadas são células de câncer de mama humano responsivas a estrógenos, MCF-7 (Fig. 7) ou T47-D (ZACHAREWSKI, 1997). Todavia, para assegurar a confiabilidade da técnica, é necessário garantir que a linhagem celular empregada apresente elevada especificidade de resposta a estrógenos e não prolifere em resposta à ligação a outros receptores, como por exemplo, àqueles responsáveis por fatores de crescimento (JONES et al., 1998).
Figura 7 - Fotomicrografia óptica de células MCF-7
(Fonte: TGR Biosciences)
As propriedades antiestrogênicas e citotóxicas dos fitoestrógenos podem ser avaliadas em algumas linhagens tumorais. Muitos estudos in vitro ilustram o efeito bifásico dos fitoestrógenos em células de cultura. Quando em baixas concentrações, estimulam a proliferação, porém, quanto em concentrações suprafisiológicas, ocorre inibição do crescimento celular. Se um fitoestrogênio “forte” e um estrogênio natural estiverem presentes em concentrações fisiológicas, os fitoestrógenos irão antagonizar a ação do estrogênio, reduzindo a proliferação celular (HARGREAVES et al., 1999).
O ensaio E-screen, utilizado neste estudo, foi desenvolvido por Soto et al. (1992, 1995) com este propósito. Além disso, é também baseado no crescimento das células MCF-7, na presença de estrógenos ou compostos que os mimetizam. Essas células são recomendadas devido a sua reprodutibilidade e sensibilidade estável a esses hormônios. O método pode diferenciar compostos agonistas, agonistas parciais ou inativos
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(KORACH e MCLACHLAN, 1995), comparando a proliferação celular obtida em concentrações variáveis da substância em análise com aquelas observadas após exposição a controles positivos e negativos (SOTO et al., 1992; OH e CHUNG, 2004).
A linhagem celular de câncer de mama (MCF-7) foi derivada de uma efusão pleural de uma paciente com carcinoma mamário metastático, previamente tratado com radioterapia e terapia hormonal (SOULE et al., 1973). Desde aquela época, essas células passaram por inúmeras mudanças, e os estudos demonstram que variantes da linhagem MCF-7 mostram diferenças intrínsecas em características como a taxa de proliferação de estrogênio-dependentes, tempo de duplicação e susceptibilidade a apoptose (VILLALOBOS et al., 1995).
Para desenvolver um bioensaio é necessário escolher qual o efeito será avaliado. A proposta para um bioensaio pode se basear na definição que diz que os estrógenos são substâncias capazes de interferir na proliferação de órgãos do trato genital feminino. Os estrógenos induzem a proliferação dessas células e o E-screen baseia-se nessa propriedade (SOTO et al., 2006). Segundo Rajapakse (2004), de todos os ensaios utilizados para triagem de substâncias químicas com atividade endócrina, o E-screen apresenta o maior nível de complexidade biológica, podendo isso ser considerado como um ponto de eficácia. Muitos fatores devem ser considerados durante o planejamento experimental, desenvolvimento e avaliação da combinação de efeitos estrogênicos e antiestrogênicos por diferentes mecanismos.
Outro ensaio também utilizado neste trabalho e muito usado para avaliar o potencial de desregulação endócrina de uma substância é o ensaio de levedura recombinante (RYA) (CÉSPEDES et al., 2004). No ensaio RYA, utilizado neste estudo, a atividade estrogênica é resultado da interação direta com o RE (ZACHAREWSKI, 1998; WANDA et al., 2006). Esses ensaios com gene repórter utilizando células de levedura é uma alternativa rápida de triagem quando comparados com estudos in vivo ou cultura de células (PASSOS et al., 2009).
No RYA, as cepas de leveduras (Saccharomyces cerevisiae) são geneticamente modificadas e expressam dois elementos genéticos: um gene sensor, o RE humano, e um gene repórter, contendo o elemento responsivo a estrógeno do gene da vitelogenina B1 de Xenopus laevis, o qual promove a expressão da enzima β-galactosidase pela ativação do gene lacZ (Fig. 8) (GARCIA-REYERO et al., 2001; 2005). O gene repórter é construído de uma forma que esta enzima só será expressa na presença do complexo receptor-ligante, imitando o mecanismo pelo qual muitos genes responsivos a
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hormônios são regulados nos vertebrados (CÉSPEDES et al., 2005; NOGUEROL et al., 2006). A expressão do gene repórter é então monitorada por sua atividade enzimática utilizando substratos, cujos produtos são fáceis de detectar e quantificar (NOGUEROL et al., 2006).
Neste teste é utilizado como substrato 4-metilumbeliferona β-D- galactopiranosídeo (MuGal). A hidrólise desde substrato promove a formação de um produto fluorescente 4-metilumbeliferona, o qual é medido em espectrofotômetro (355 nm de excitação e 460 nm de emissão). Uma curva dose-resposta relacionando a atividade da enzima β-galactosidase com a concentração de estradiol é usada para atribuir um valor estradiol-equivalente (EEQ) (NOGUEROL et al., 2006; FERNANDEZ et al., 2009).
Figura 8 - Mecanismo de ação exercido pelo RYA
Duas características da célula leveduriforme são fundamentais para o sucesso do RYA. Primeiro, a levedura não tem um sistema endógeno homólogo de receptores nucleares de vertebrados que poderiam interferir com o ensaio. Em segundo lugar, o processo de alteração conformacional e pós-transducional da proteína de vertebrados em levedura é muito semelhante ao das células de mamíferos, o que resulta na preservação da estrutura do receptor quando expresso em levedura. Essa caracteristica é primordial, uma vez que a estrutura correta do domínio de ligação do receptor determina a especificidade do sistema, isto é, sua capacidade de distinguir entre ligantes e não ligantes (GREEN e CHAMBON, 1991; NOGUEROL et al., 2006). Além disso, este ensaio permite a avaliação de um grande número de amostras ambientais e susbtâncias
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químicas a um baixo custo (CÉSPEDES et al., 2004; FERNANDEZ et al., 2008). O RYA mostrou-se específico, sensível e reprodutível (PASSOS et al., 2009), tem um tempo experimental relativamente curto e não exige técnica asséptica rigorosa quando comparado a outros ensaios de células cultivadas (KAMATA et al., 2011).
A combinação destes ensaios, RYA e E-screen, permite estimar a afinidade de diferentes compostos ao RE humano, bem como explorar as possíveis consequências fisiológicas dessa interação (GARCIA-REYERO et al., 2004).