Ensaios de migração e invasão ( wound healing e RTCA)

Migração e invasão são fatores biológicos vitais e característicos de células tumorais agressivas e malignas. A metástase é um grande problema no tratamento do câncer e um indicador de mau prognóstico entre pacientes com câncer, é um tumor fisiológico bastante complexo, que pode se desenvolve r depois de anos ou mesmo décadas do diagnóstico do tumor primário. O carcinoma mamário 4T1 é uma linhagem altamente tumorigênica e agressiva, podendo migrar para vários locais distantes, incluindo linfonodos,sangue, cérebro, pulmão, fígado e osso (Yueh-Jung Wu,2020). Para superar esse obstáculo, é necessário estratégias para interromper as atividades fisiológicas necessárias para o crescimento e sobrevivência do tumor.

Afim de investigar a capacidade de migração das células sobreviventes após o tratamento com as nanoemulsões foi realizado o ensaio de ensaio de wound healing em células 4T1 após o tratamento com as nanoemulsões na concentração de 180 ug/mL por um período de 24h, onde após esse período foi feito uma ferida nas células sobreviventes e foi feito o registro das fotos no tempo de 0h e após 24h (figura 34), para assim analisar a área inicial e final da ferida, comparando aos seus respectivos poços iniciais, identificando a porcentagem de migração das células.

Figura 34 - Migraç ão de células de c ãnc er de mama (4T1-Luc) medida pelo ens aio wound healing. As c élulas foram previamente t rat adas com nanoemuls ão à P eNE (nanoemuls ão de pequi); P eNE+PE G (nanoemulsão de óleo de pequi revestida com PE G); P eNE +AF (nanoemuls ão de óleo de pequi revestida c om Ácido Fólic o); Branco (formulação lecitina e P BS); Branc o P E G (formulação lecitina, PE G e P BS); Branco AF (formulação lecitina, Ácido Fólico e PBS); OL (óleo livre), na conc ent raç ão de 180µg/mL comparados com controle por 24 horas. Linhas vermelhas repres ent am a área da ferida. Quantificaç ão da porcent agem de fec hamento da ferida em relaç ão ao controle medida pela Imagem J. A NOVA de uma via (*** p <0, 05).

Depois de calculada a porcentagem de migração, todos os grupos foram avaliados em comparação ao grupo controle no que diz respeito a porcentagem de migração após 24h, onde o fechamento da ferida foi equivalente a ±53% após 24h, demonstrando como esperado a capacidade de migração das células 4T1. O grupo tratado com o Branco apresentou um fechamento ±81%, mostrando uma capacidade de migração estatisticamente significativa maior comparada ao grupo controle, colaborando com o resultado de MTT no período de 24h onde a

viabilidade celular também foi maior em relação ao controle, onde podemos inferir que teve um aumento no número de células nessa condição (figuras 33). Já os brancos PEG e AF migraram equivalente ao controle.

Quando comparamos os tratamentos feitos com as nanoemulsões, PeNE+PEG, PeNE, PeNE+AF, a ferida foi fechada ±32%, ±30% e ±17% respectivamente, demonstrando uma redução significativa da migração comparados aos controle, onde PeNE+AF foi a que melhor inibiu a migração. O óleo livre não teve diferença em comparação ao controle, evidenciando que quando ele é nanoestruturado seu efeito é potencializado (figura 34).

O analisador de células em tempo real (RTCA) é uma tecnologia baseada em impedância que pode ser usada para monitoramento em tempo real das propriedades das células, como aderência, proliferação, migração, invasão e citotoxicidade ((MORINI et al., 2015). Resultados obtidos no RTCA, todas as formulações reduziram a migração, com destaque para a PeNE+PEG e PeNE+AF que reduziram significativamente a migração celular comparada ao controle como observado abaixo na figura 35. Essa diminuição da migração corrobora com resultados obtidos pelo ensaio de wound healing, O óleo livre migrou como o controle, demonstrando assim que mais uma vantagem no uso sistema nanoestruturado.

Figura 35- A nálise de migraç ão em células em tempo real. P erfil da migraç ão de células de cânc er de mama (4T1-Luc ), após o tratament o c om nanoemuls ão PeNE (nanoemuls ão de pequi); P eNE+PE G (nanoemuls ão de óleo de pequi revestida com P EG); P eNE+ AF (nanoemuls ão de óleo de pequi revestida com Ácido Fólic o); OL (óleo livre) por 24 horas na conc entração de 180µg/mL A NOVA unidirecional (pós -test e de Tukey ) ** = p < 0,05

Em estudo realizado por PAKDEMİRLİ, et al 2019, que examinou o efeito do ácido fólico em células endoteliais, observou-se que entre os grupos tratados, a taxa mais rápida de fechamento de feridas foi observada nas células tratadas com ácido fólico. Já Hui‑ Chen Wang et al, 2019, investigaram se o ácido fólico associado a progesterona (que é uma indudora de proliferação celular) interfere na migração de células de câncer de mama, onde foi observado que essa associação aboliu a proliferação e migração de células de câncer de mama. Esse efeito também foi visto em Reza Abazari et al, 2019, demonstrou que estrutura metal-orgânica funcionalizada com amina do ácido fólico também inibe a migração de MCF-7.

Para o ensaio de invasão também utilizando a técnica de RTCA, foi possível observar na figura 36, que as células tratados com PeNE+AF e PeNE perderam de maneira significativa a capacidade de invasão. Já PeNE+PEG aumento essa capacidade em comparação ao controle. Portanto com base nos resultados apresentados as células tratadas com PeNe+AF foram as que apresentação menor índice de migração e invasão de células 4T1.

Figura 36 - A nálise de invasão de células em tempo real. P erfil de invasão de células de câncer de mama (4T1-Luc), após o t rat ament o c om nanoemuls ão P eNE (nanoemuls ão de pequi); PeNE+ PE G (nanoemuls ão de óleo de pequi revestida com PE G); PeNE+AF (nanoemuls ão de óleo de pequi revestida c om PE G); P eNE+ AF (nanoemulsão de óleo de pequi revestida com Ácido Fólic o); OL (óleo livre) por 24 horas na c oncentraç ão de 180µg/mL A NOVA unidirecional (pós -test e de Tukey ) ** = p <0, 01.

Os resultados dos ensaios biológicos em células de câncer de mama (4T1) após 24 horas de exposição às PeNE, PeNE+PEG e PeNE+AF foram compilados na tabela 4.

Tabela 4 - Compilação dos result ados dos ens aios biológic os em c élulas de cânc er de mama 4T1 após 24h de ex posição a nanoemuls ões a bas e de óleo de p equi na concent raç ão de 180µg/mL

ENSAIOS IN VITRO PeNE PeNE+PEG PeNE+AF

VIABILIDADE CELULAR +++ +++ +++ MORFOLOGIA ++ ++ ++ PROLIFERAÇÃO CELULAR CP --- ++ ++ PROLIFERAÇÃO CELULAR LP ++ --- ++ FRAGMENTAÇÃO DE DNA + ++ ++ CICLO CELULAR --- --- --- PERMEABILIZAÇÃODA MEMBRANA LISOSSÔMICA ++ ++ ++ POTENCIAL DA MEMBRANA MITOCONDRIAL ++ ++ + INTEGRIDADE DE MEMBRANA + ++ + MIGRAÇÃO W H + ++ +++ MIGRAÇÃO RTCA + ++ +++ INVASÃO RTCA + --- ++