Ensaios de toxicidade celular (teste MTT) em células Caco-2

A avaliação da toxicidade de fármacos na mucosa intestinal é importante para a indústria farmacêutica devido a via oral ser umas das rotas utilizadas para a administração (LOH et al., 2012). A linhagem celular Caco-2 é frequentemente utilizada como substituto do intestino humano, uma vez que estas células se diferenciam espontaneamente após 3-4 semanas em fenótipos altamente polarizados (RODRIGUEZ-JUAN et al., 2001) com tight junctions (espaço existente entre uma célula e outra por onde permeiam as micro e nanopartículas) funcionais (LEONARD et al., 2000) quando cultivadas em membranas porosas sob condições normais de cultura. Por estas razões, as células Caco-2 foram selecionadas para investigar a citotoxicidade das micro e nanopartículas produzidas a partir da complexação entre os polímeros quitosana e pectina.

A utilidade das micro e nanopartículas (NCXs) em melhorar a absorção oral de fármacos hidrofílicos como a insulina foi avaliada a partir de ensaios de toxicidade usando células Caco-2 (Figuras 25 e 26). Para avaliar a pureza e a segurança destes NCXs carregados ou não com o fármaco, células Caco-2 foram tratadas com diferentes concentrações de partículas e a viabilidade delas foi determinada pelo teste MTT.

A viabilidade das células Caco-2 após 4h de aplicação dos NCXs carregados ou não com insulina e obtidos usando quitosana com GA 15,0 % está apresentada na Figura 25. O controle negativo é sem adição de NCXs (apenas meio de cultivo MEM), enquanto que no positivo foi promovida a morte das células. É possível observar que os sistemas com NCXs sem insulina (Figura 25a) apresentaram maior porcentagem de viabilidade celular que os NCXs contendo insulina (Figura 25b), indicando que o fármaco adicionado ao sistema poderia estar agindo na

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citotoxicidade celular em estudo. A viabilidade das células não foi influenciada significativamente pelo aumento da concentração de NCXs, bem como pela relação de cargas para os sistemas sem insulina (Figura 25a), apresentando valores da ordem de 90,0 % para todas as formulações. Entretanto, a adição de insulina ao sistema (Figura 25b), diminuiu a porcentagem de células viáveis para cerca de 80,0 % na relação de carga 0,25 e para até 78,0 % na concentração mais baixa (5,0 μg/cm2) da relação de carga 5,00.

Figura 25. Viabilidade celular (teste MTT) das células Caco-2, 4 h após aplicação das micro e nanopartículas formuladas com quitosana (GA 15,0 %) e pectina em diferentes relações de carga n+/n-: (a) NCXs sem insulina e (b) NCXs com insulina.

5 10 20 50 ₁₀₀ Contr ole po sitivo Controle negat ivo 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidade celular (%) Concentração g/cm2 Relação de carga 0,25 Relação de carga 5,00 5 _{10 20 50 100} Controle positi vo Controle negat ivo 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidade celular (%) Concentração g/cm2 Relação de carga 0,25 Relação de carga 5,00 (a) (b)

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Apesar do aumento na concentração de NCXs de 5,00 para 100,0 μg/cm2

na relação de carga 5,0 para o sistema contendo insulina (Figura 25b) ter promovido maior viabilidade celular, considerando o desvio padrão, a concentração dos NCX é a mesma, com valores muito semelhantes aos encontrados no sistema sem insulina para a concentração máxima de NCXs (100 μg/cm2

), na ordem de 92,0 %.

De acordo com Soliman et al. (2014), esta diferença observada entre as relações de carga 0,25 (excesso de cargas negativas provenientes da pectina) e 5,00 (excesso de cargas positivas provenientes da quitosana), mais acentuada na presença do fármaco, poderia ser explicada devido a quitosana ser reconhecidamente um agente de redução da viabilidade celular, promovida pela interação entre os grupos amino catiônicos do polímero e a membrana celular.

NCXs contendo ou não insulina, elaborados a partir de quitosana com GA de 28,8 % e diferentes relações de carga também tiveram a sua influência na viabilidade celular (Figura 26). Para o sistema sem a presença do fármaco (Figura 26a), foram observadas células viáveis com níveis de 80,0 %, com exceção da relação de carga 0,25 na concentração de 10,0 μg/cm2

, que apresentou valores da ordem de 75,0 %. Mesmo com valores de porcentagem de viabilidade celular inferiores aos observados para os sistemas produzidos utilizando quitosana com GA 15,0 %, os sistemas obtidos com a quitosana de GA 28,8 % sem insulina podem ser considerados viáveis para as células Caco-2. Entretanto, diferença significativa foi observada quando se adicionou insulina ao sistema (Figura 26b), obtendo-se valores abaixo de 70,0 % e em alguns casos (concentrações de 50,0 e 100 μg/cm2

) inferiores a 60,0 % de células viáveis. Com estes resultados, poder-se-ia afirmar que os NCXs contendo insulina obtidos com quitosana de GA 28,8 % foram tóxicos para as células Caco-2. Ainda neste sistema (Figura 26b) é possível observar que o aumento na concentração de NCXs de 5,00 para 100,0 μg/cm2

apresentou tendência em reduzir a viabilidade celular, indicando que a elevação na quantidade de micro e nanopartículas tornou-se cada vez mais tóxica para as células. Biswas et al. (2015) afirmaram que para sistemas envolvendo nanopartículas, é considerado efeito citotóxico, resultados de viabilidade celular abaixo de 80,0 %.

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Figura 26. Viabilidade celular (teste MTT) das células Caco-2, 4 h após aplicação das micro e nanopartículas formuladas com quitosana (GA 28,8 %) e pectina em diferentes relações de carga n+/n-: (a) NCXs sem insulina e (b) NCXs com insulina.

Campos et al. (2004) realizaram estudos com nanopartículas de quitosana obtidas em meio aquoso ácido (abaixo de pH 6,5) para facilitar a ionização dos grupos amino da quitosana. A resultante de cargas positiva permitiu que estas nanopartículas se associassem com as cargas negativas dos resíduos de ácido siálico presente no mucus, conferindo deste modo uma propriedade mucoadesiva. Entretanto, Loretz e Bernkop-Schnurch (2007) afirmaram que a redução da viabilidade celular poderia ser resultado de interações eletrostáticas entre as nanopartículas de quitosana e a membrana celular. Biswas et al. (2015) afirmaram que a

5 _{10 20 50 100} Controle positi vo Controle negat ivo 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidade celular (%) Concentração g/cm2 Relação de carga 0,25 Relação de carga 5,00 5 _{10 20 50 100} Controle positi vo Controle negat ivo 0 20 40 60 80 100 120 Viabilidade celular (%) Concentração g/cm2 Relação de carga 0,25 Relação de carga 5,00 (a) (b)

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citotoxicidade está relacionada à densidade de cargas presente nas partículas e sugerem ainda que a toxicidade pode ser maior em particular com elevada densidade de cargas positivas.

Jia et al. (2009) estudaram o transporte de nanopartículas de quitosana e moléculas em células Caco-2 e observaram que a citotoxicidade foi influenciada principalmente pela massa molecular da quitosana, bem como a densidade de cargas catiônicas. Isso promoveu maior interação da quitosana com a membrana celular e consequentemente, o dano das células. Segundos os mesmos autores, elevadas concentrações de nanopartículas (1000 μg/mL) promoveram toxicidade às células Caco-2, com valores de viabilidade celular em torno de 80,0 %. Sadeghi et al. (2008) avaliaram a permeação de insulina através de monocamadas de células Caco-2 utilizando nanopartículas de quitosana e seus derivados (trimetil-quitosana, dimetiletil- quitosana, dietilmetil-quitosana e trietil-quitosana), e concluíram que independente da formulação empregada, os polímeros não foram citotóxicos para as células (menos de 1,0 % das células morreram) nas concentrações estudadas. Zhang e Zhao (2015) investigaram a preparação de nanopartículas de quitosana a partir da gelificação iônica com tripolifosfato de sódio, e obtiveram viabilidade celular acima de 84,0 % para todas as nanopartículas estudadas e sugeriram que o sistema obtido tem potencial aplicação para liberação de substâncias antioxidantes.

O efeito da adição de insulina na viabilidade das células Caco-2 também foi avaliado adicionando somente insulina nas células Caco-2 (Figura 27). O aumento da concentração de insulina de 5,00 para 100 μg/cm2

reduziu o número de células viáveis, obtendo-se valores mínimos e máximos de 75,0 % e 90,0 %, respectivamente. É importante ressaltar que esta análise foi feita considerando a mesma concentração utilizada nos experimentos com NCXs contendo ou não insulina, ou seja, aqui, a quantidade de insulina foi superior. Para os NCXs, a quantidade de insulina presente representa no máximo 30,0 % de cada concentração uma das concentrações estudadas.

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Figura 27. Viabilidade celular (teste MTT) das células Caco-2, 4 h após aplicação de diferentes concentrações de insulina.

Com estes resultados, poder-se-ia afirmar que a adição de insulina aos NCXs promove redução da viabilidade celular, sem, no entanto, ser a principal causa que poderia tornar os sistemas tóxicos às células.