Ensaios ecotoxicológicos

Neste trabalho, foram utilizados diferentes ensaios ecotoxicológicos de exposição direta para avaliação da função habitat do solo: mortalidade e reprodução com E. fetida e germinação de sementes de L. sativa. Os ensaios foram efetuados diretamente no solo a testar (100%), ou numa diluição deste solo teste com solo artificial (75, 50 e 25% p/p) preparado de acordo com a norma OECD (OECD 207, 1984) (10% p/p de turfa de estagno moída, 70% p/p de areia de quartzo, 20% p/p de argila de caulino e 1% p/p de carbonato de cálcio em pó para ajustar o pH a 6,5. Este solo artificial foi utilizado, nos ensaios ecotoxicológicos, como o solo controlo (0%).

Sempre que possível, foi calculado algum dos seguintes parâmetros ecotoxicológicos:  EC50: concentração para a qual se verifica 50% de redução no parâmetro em análise,

seja ele, por exemplo, sobrevivência, número de juvenis, número de sementes germinadas, etc.;

 NOEC – Concentração máxima para a qual ainda não se observa um efeito tóxico significativo (do inglês “No observable effect concentration”);

 LOEC – Concentração mínima para a qual já se observa um efeito tóxico significativo (do inglês “Lowest observable effect concentration”).

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6.6.1. Ensaio de mortalidade com Eisenia fetida

O ensaio de toxicidade aguda utilizando a minhoca E. fetida foi conduzido de acordo com a norma OECD (OECD 207, 1984). Para cada solo a testar, colocaram-se 400 g de solo, ou de uma sua diluição com solo artificial (25, 50 e 75%, p/p), em caixas plásticas fechadas (2 l de capacidade, área 200 cm2, que proporciona uma altura de solo húmido de 5-6 cm), perfuradas na tampa por forma a permitir trocas gasosas com o exterior. O solo artificial foi utilizado como controlo negativo (0%), tendo-se preparado quatro repetições de cada ensaio, à exceção do solo 5, em que só se prepararam três réplicas de cada concentração. As misturas foram colocadas a 65% da sua capacidade de retenção de água, por adição de água destilada, 24 h antes do início do ensaio. Decorridas 24 h após a preparação das misturas, introduziram- se dez minhocas em cada uma das caixas. As minhocas foram selecionadas de culturas mantidas em laboratório, tendo-se o cuidado de usar apenas organismos adultos, com clitélio bem identificado, pesando entre 0,2 e 0,4 g. Os testes foram conduzidos em câmara de ambiente controlado (Fitoclima S 600 da Aralab), a 20 ± 2ºC, utilizando iluminação contínua.

A mortalidade dos organismos foi registada ao fim de 14 dias de exposição.

6.6.2. Ensaio de reprodução usando E. fetida

Minhocas adultas são expostas a um intervalo de concentrações do solo teste. O intervalo de concentrações é escolhido de forma a utilizar valores que possam causar efeitos subletais num período de exposição de quatro semanas. Após esse período de exposição, os adultos serão então removidos do solo e os efeitos na reprodução são verificados, após mais quatro semanas, por contagem dos juvenis presentes no solo.

O ensaio crónico de reprodução utilizando a minhoca E. fetida foi conduzido de acordo com a norma OECD (OECD 222, 2004). Para cada solo a testar, colocaram-se 400 g de solo, ou de uma sua diluição com solo artificial (25, 50 e 75%, p/p), em caixas plásticas fechadas (2 l de capacidade, área 200 cm2, que proporciona uma altura de solo húmido de 5-6 cm), perfuradas na tampa por forma a permitir trocas gasosas com o exterior. O solo artificial foi utilizado como controlo negativo (0%), tendo-se preparado quatro repetições de cada ensaio, à exceção do solo 5, em que só se prepararam três réplicas de cada concentração. As misturas foram colocadas a 65% da sua capacidade de retenção de água, por adição de água destilada, 24 h antes do início do ensaio. Decorridas 24 h após a preparação das misturas, introduziram-se dez minhocas em cada uma das caixas. As minhocas foram selecionadas de

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culturas mantidas em laboratório, tendo-se o cuidado de usar apenas organismos adultos, com clitélio bem identificado, pesando entre 0,2 e 0,4 g. Os testes foram conduzidos em câmara de ambiente controlado (Fitoclima S 600 da Aralab), a 20 ± 2ºC, utilizando um fotoperíodo de 16 h dia e 8 h noite, com adição de 5 g de substrato (estrume bovino moído) uma vez por semana, durante 28 dias.

Ao fim dos 28 dias, as minhocas vivas foram retiradas do solo, contadas e pesadas. Os recipientes foram colocados de seguida a incubar durante mais quatro semanas. No final do teste, o número de juvenis é contado. Sempre que possível, calcularam-se os valores de NOEC e de LOEC.

6.6.3. Ensaio de germinação com Lactuca sativa L.

Os ensaios de germinação foram executados de acordo com o protocolo descrito pela Norma ISO/DIS 17126 (2004), utilizando sementes de alface (L. sativa). Foram utilizadas 400 g de solo, ou diluições deste com solo artificial (25, 50 e 75% v/v), em caixas de plástico transparente quadradas (10 cm × 10 cm de base). O solo artificial foi utilizado como controlo negativo (0%), tendo-se preparado quatro repetições de cada ensaio. Os solos foram colocados a 70% da sua capacidade de retenção de água.

Foram colocadas 40 sementes da espécie testada em cada caixa, tendo-se distribuído as sementes de forma homogénea sobre a superfície do solo. De seguida, foi colocada sobre esta superfície uma camada fina de areia seca.

As placas foram incubadas a 20 ± 2ºC, com um fotoperíodo de 16 h dia e 8 h noite durante 120 h (5 dias). Durante as primeiras 48 h, esta incubação foi feita no escuro, mantendo, para isso, as placas de Petri num tabuleiro dentro de um saco de polietileno preto. Passadas 48 h, o saco é retirado e as placas de Petri são novamente colocadas a incubar nas condições do ensaio.

Ao fim de 120 h, registou-se o número de sementes germinadas em cada caixa. Sempre que possível, calcularam-se os valores de EC50.

6.6.4. _{Determinação dos metais acumulados nas minhocas (bioacumulação)}

No final das primeiras quatro semanas do ensaio de reprodução descrito anteriormente, as minhocas foram lavadas, pesadas e colocadas em caixas plásticas tapadas, forradas com tiras de papel absorvente embebidas em água de Mili-Q, de modo a permitir a sua depuração.

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Apos a depuração, as minhocas foram novamente lavadas, pesadas, colocadas em tubos de centrífuga e congeladas durante 4 horas para as anestesiar antes da sua digestão.

Antes da sua digestão, as minhocas foram transferidas para um cadinho de porcelana e secas em estufa (Memmer UNE 400) a 105ºC até peso constante, de modo a que o teor em metais pudesse ser reportado ao seu peso seco.

O protocolo de digestão utilizado foi adaptado de Conder et al. (2002). A digestão foi efetuada com 10 ml de HNO3 conc. (65% p/p, d=1,43). A mistura foi deixada em contacto

durante 18 horas a 25ºC, após o que se aqueceu em banho-maria de argolas (Selecta Precisterm) até evaporação completa do ácido. De seguida foi efetuada uma redissolução usando 10 ml de HNO3 0,5 M. Deixou-se arrefecer e filtrou-se através um filtro Whatman nº

40. O volume foi completado com HNO5 0,5 M e armazenado em frascos de polietileno a 4ºC

para análise elementar. Foram realizadas quatro réplicas por cada amostra de solo e um ensaio em branco por cada grupo de amostras.

A análise dos metais e/ou metalóides foi feita por espectrofotometria de absorção atómica com atomização por chama (Varian Spectra AA 220FS) ou com atomização eletrotérmica (Varian Spectra AA 220Z).