Ensaios funcionais em células humanas HEK-293

Os domínios PASa e PASb, ambos presentes nas subunidades -α e -β de HIF (Figura 2), são os elementos essenciais e participam diretamente na formação do heterodímero funcional [33]. Após as confirmações experimentais da integridade

estrutural do domínio PASb da variante mutante PASb-3a.AF, e da sua incapacidade de interagir com lipídeos, demos início aos experimentos funcionais em modelos de células humanas usando as construções completas das proteínas. O objetivo inicial de tais experimentos foi a confirmação da atividade da isoforma 3α9 de HIF num modelo celular humano, bem como a identificação dos potenciais lipídeos interagentes de HIF-3α nesse contexto, dado que a única confirmação experimental até o momento foi feita detectando-se liso-fosfolipídeos bacterianos, resultantes do sistema heterólogo de expressão do domínio componente PASb-3α [34].

A função celular de controle da expressão gênica por HIF é relevante em condições de hipóxia; principalmente frente a potencialidade da interação dessas proteínas com lipídeos. Porém, nos experimentos iniciais em que se realizou a expressão ectópica dos genes somente em normóxia, observou-se sinal intenso de expressão proteica tanto para a amostra selvagem quando para a amostra mutante. (Figura 8.a). A superexpressão da isoforma HIF-3α9 em níveis muito maiores do que o natural para a célula possivelmente promove uma saturação da via de degradação pelo proteassomo. (Figura 1) [15], fazendo com que mesmo em normóxia a proteína se mantenha estável. Somado a isso, a estufa de hipóxia disponível em nosso laboratório estava indisponível para uso (por problemas de funcionamento), durante a maior parte do período em que esse projeto se desenvolveu; optamos somente então pela realização dos ensaios celulares iniciais em normóxia, afim de se confirmar a funcionalidade das construções selvagem e mutante expressas ectopicamente, bem como identificar os possíveis lipídeos interagentes.

Neste sentido, os primeiros experimentos foram baseados na simples análise da capacidade de 3α9.wt e 3α9.AF de ativar a transcrição gênica, estimulando a expressão do gene-repórter sob controle de promotores contendo elementos responsivos de HIF. Foi utilizada a sequência do elemento HRE (hypoxia response

element) 5’ –ACGTG- 3’ do gene ENO1 (enolase), tida como sequencia canônica para

reconhecimento por parte do fator de transcrição induzível por hipóxia [12]. O sistema plasmidial utilizado e denominado de p2.1, utiliza a luciferase do vagalume Photinus

pyralis (aqui referida adiante como firefly) como gene-repórter e permite a detecção

quantitativa de luminescência, proporcional a atividade transcrição de HIF, na faixa de 550 – 570 nm . O experimento é acompanhado por um controle negativo (denominado p2.4), cujo elemento HRE upstream da luciferase é mutado (5’ – AAAAG – 3´), e portanto, insensível a ação de HIF.

O plasmídeo pGL4.75 foi co-transfectado em conjunto. Ele contém o gene que codifica para a luciferase da espécie de cnidário marinho Renilla reniforms (aqui referida como renilla). A expressão de renilla está sob controle de um promotor constitutivo CMV (cytomegalovirus), e produz luz azul, na faixa de 480 nm. A razão entre o sinal de luminescência de firefly pela luminescência de renilla corrige para os efeitos de diferentes eficiências de transfeccção e quantidades de células por poço para as diferentes amostras analisadas no ensaio. Portanto, como resultado, são reportadas as luminescências relativas (firefly/renilla).

Foi utilizado um controle experimental (referido como controle negativo (-)) visando corrigir os dados de atividade considerando a atividade transcricional de HIF endógena somente, caso presente. Nesse controle os plasmídeos codificando pelas luciferases de firefly e renilla foram cotransfectados com o plasmídeo pcDNA vazio (sem expressão de HIF-3α ectópica). Também, foram otimizadas as quantidades de DNA usadas em cada transfecção para a expressão ectópica transiente de modo que nas análises de imunodetecção (Western blotting), a intensidade das bandas correspondentes as duas isoformas estivessem equiparáveis, considerando o controle de carregamento no sinal da vinculina (Figura 8.a).

A Figura 8.b reporta os dados reproduzidos ao longo de 4 replicatas independentes (cada uma delas realizadas em triplicatas ou quadruplicatas), sob as mesmas condições experimentais, e usando passagens diferentes de HEK293 em cada replicata. O sinal de ativação na expressão de luciferase de firefly é reportado através da razão das atividades de HIF-3α para p2.1 e para o controle negativo p2.4 (p2.1/p2.4). Comparado com o controle negativo (sem superexpressão ectópica de HIF-3α), cujos níveis relativos de expressão p2.1/p2.4 são 0,7 ± 0,1 (média ± erro padrão), as presenças de 3α9.wt e 3α9.AF induziram a expressão do gene-repórter em p2.1 a níveis 12,0 ± 0,6 e 6,5 ± 0,9, maiores que em p2.4, respectivamente.

A princípio, nos baseamos na premissa de que os níveis de atividade transcricional induzidos por 3α9.wt e 3α9.AF deveriam ser equiparáveis, uma vez que a capacidade de dimerização dessas subunidades com HIF-1β deve ser mantida, em função da manutenção das integridades estruturais, como estudado para as construções recombinantes. Todavia, neste ensaio, a atividade de 3α9.wt foi praticamente duas vezes maior que a de 3α9.AF (1.8 ± 0.3), em uma diferença considerada estatisticamente significativa (p < 0.001, test-t de Welch). Dentro do desenho experimental elaborado, pode-se supor que o impedimento de ligação a

lipídeos no domínio PASb-3α de 3α9.AF tenha afetado a atividade da HIF-3α na célula. De alguma forma essa alteração estrutural pode estar sendo responsável por impedir a interação entre as subunidades α e β no momento da formação do complexo heterodimérico, ou mesmo prejudicando a interação da subunidade com outras moléculas coativadoras da transcrição; porém, essas hipóteses necessitam de validação.

Figura 8. Ensaio de gene repórter para 3α9.wt vs 3α9.AF

a. Western Blotting para a análise da expressão proteica de HIF-3α9 nas amostras

submetidas ao ensaio de luciferase. A banda de superexpressão de HIF- 3α9 é detectada com o anticorpo anti-HIF-3a, e a marcação com anti-vinculina é usada como controle de carregamento.

b. Quantificação da atividade relativa da luciferase. Os valores médios são de 12,0 para 3α9.wt vs 6,5 para 3α9.AF. Teste-t de Welch, ***p < 0,001.

5.3.2. PCR quantitativo para a análise da regulação de genes alvos de HIF-3α9 Após a confirmação das funcionalidades das construções ectópicas em modelos de gene-repórter, avaliamos as atividades, por qPCR, de 3α9.wt e 3α9.AF sobre genes endógenos exclusivamente controlados por HIF-3α, e não por HIF-1α ou HIF-2α [12]. Os dados estão reportados na Figura 9 apresentam as médias seguidas dos respectivos valores de desvio padrão para três replicatas independentes, cada uma delas realizadas em triplicatas. As quantificações relativas dos níveis de amplificação dos genes-alvo (RQ= 2-ΔΔCt) foram corrigidas pelos níveis de expressão de HIF-3α.

Observa-se que os três genes selecionados tiveram suas expressões significativamente aumentadas quando da superexpressão de 3α9.wt e 3α9.AF, comparado com controle negativo expressando mKO2 (Figura 9). Todavia, análises estatísticas sugerem equivalência de atividade entre 3α9.wt e 3α9.AF sobre LC3C e

SQRDL: 3α9.wt e 3α9.AF induziram a expressão do gene LC3C a níveis 10,1 (+ 1,0 e

-1,1) e 11,8 (+ 2,6 e -2,9) vezes (p = 0,18, teste-t de Welch) e do gene SQRDL a níveis 15,0 (+ 1,7 e -2,0) e 16,5 (+ 4,6 e -5,4) vezes (p = 0,47, teste-t de Welch), respectivamente. Em contrapartida, 3α9.AF induziu a expressão de REDD1 em níveis 1,6 vezes (± 0,4) maiores, estatisticamente significativos, quando comparado com 3α9.wt (RQ = 13, 9 (+ 3,4 e -3,9) e 8,8 (+ 0,9 e -0,9), respectivamente; p < 0,01, teste- t de Welch).

Aqui, de acordo com o hipotetizado por conta da manutenção da integridade estrutural, as atividades de HIF-3α selvagem e mutante foram praticamente equivalentes.

Figura 9. PCR quantitativo

a. Western Blotting das células usadas na extração de RNA. A banda de superexpressão de HIF- 3α9 é detectada com o anticorpo anti-HIF-3a, e a marcação com anti- vinculina constitui o controle de carregamento. Perecebe-se que a banda correspondente a HIF-3α9 para a amostra mutante é visivelmente menos intensa quando comparada a mesma banda para a amostra selvagem. Porém, uma normalização de intensidade de HIF-3α por intensidade de vinculina para as amostras indica que a razão entre proteína expressa e controle de carregamento está equiparável. (Os valores de normalização para mKO2, WT e AF são, respectivamente: 0, 0,857 e 0,858)

b. Quantificação relativa dos níveis de expressão dos genes alvo de HIF-3α9. Os valores são, com relação a 3α9.WT e 3α9.AF, respectivamente, 10,1 e 11,8 para o gene LC3C; 13,9 e 8,8 para o gene REDD1; 15 e 16,5 para o gene SQRDL.