Ensaios laboratoriais

Amostra de sangue materno foi coletada durante o último trimestre de gestação e no máximo 30 dias após o parto para a contagem de linfócitos T CD4⁺, avaliação da carga viral e ensaio de genotipagem do HIV-1. Amostras de sangue dos bebês foram obtidas para sorologia anti-HIV-1, contagem de linfócitos T-CD4⁺ e diagnóstico molecular da infecção pelo HIV-1 através da detecção do RNA viral. As crianças foram consideradas não infectadas quando o RNA do HIV-1 não foi detectado nas amostras de sangue colhidas aos 30 e 120 dias de vida.

Criança com RNA viral detectável em duas amostras de sangue colhidas consecutivamente após os 30 dias de vida era considerada infectada. Para as crianças infectadas foi realizado o teste de genotipagem do HIV-1. Para as crianças expostas e não infectadas o teste sorológico ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) para detecção de IgG anti-HIV-1e 2 foi realizado durante os primeiros dois anos de vida ou até a sororreversão.

4.2.1 Ensaio Sorológico – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

78 O acompanhamento da sororreversão das crianças expostas ao HIV-1durante a gestação e não infectadas foi realizado através do ensaio imunoenzimático ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) para determinação de anticorpos anti-HIV-1 (grupos M e O) e HIV-1-2 (Wiener Laboratórios, Rosario, Argentina). O Ensaio foi realizado manualmente conforme protocolo do fabricante.

Em uma placa de poliestireno revestida por antígenos sintéticos com sequências correspondentes aos genes pol e gag foram adicionados 200µL do diluente de amostra (Albumina bovina em solução fisiológica tamponada com tampão fosfato pH 7,2) e 10µL do plasma colhido com EDTA. Em seguida, a placa foi incubada na estufa a 37°C por 30 min.

Após o período de incubação, a placa foi lavada cinco vezes com tampão de lavagem (cloreto de sódio 1,4 mol/L em tampão fosfato 100mmol/L e tensioativo não iônico 0,1g/L) diluído 10x empregando-se 300µL/vez/cubeta. Após a lavagem da placa, foi acrescentada uma gota (50µL) de conjugado (anti-imunoglobulinas humanas conjugadas com peroxidase). Após mais uma etapa de incubação em estufa a 37°C por 30 min, a placa foi lavada cinco vezes com tampão de lavagem e foram acrescentadas uma gota do substrato peróxido de hidrogênio 60 mmol/L em tampão citrato 50 mmol/L pH 3,2 e uma gota do cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) 0,01 mmol/L em ácido clorídrico 0,1N. Seguiu-se uma etapa de incubação a TA por 10 min, quando foi adicionado uma gota do ácido sulfúrico 2N para parar a reação. A leitura da densidade ótica foi realizada em espectrofotômetro em comprimento de onde de 450nm.

As amostras foram testadas simultaneamente com dois controles positivos e três controles negativos. As absorbâncias dos controles foram utilizadas como critérios de validação do teste e para cálculo do cut off: média das absorbâncias dos controles negativos mais 0,150. Amostras cuja absorbância estava acima do valor do cut off mais 10% eram consideradas reagentes, amostras com absorbância abaixo do valor do cut off menos 10%

foram consideradas não-reagentes e aquelas com valor da absorbância entre ± 10% o valor do cut off foram reportadas como indeterminadas.

4.2.2 Quantificação dos linfócitos T CD3⁺, T CD4⁺ e T CD8⁺

A análise do perfil imunológico das mães e das crianças inclusas neste estudo foi feita a partir da quantificação de linfócitos T CD3⁺, T CD4⁺ e T CD8⁺ através da imunofenotipagem das células de sangue periférico por citometria de fluxo.

79 Primeiramente, a 100µL de sangue total foram acrescentados 10µL da solução de anticorpos monoclonais contra os marcadores de superfície celular CD4, CD8 e CD3 (tripla marcação CD4/CD8/CD3 - Cytognos) marcados com os fluorocromos Isotiocinato de Fluoresceína (FITC), Ficoeritrina (PE) e Ficoeritrina –Cy5 (PE-Cy5), respectivamente. Após 15 minutos de marcação à temperatura ambiente (TA) e no escuro, foi acrescido 1mL de uma solução de lise contendo 15% de formaldeído e 50% de dietilenoglicol (Solução de Lise – FACS™ Lysing Solution, B&D) para lise das células vermelhas que podem interferir na quantificação dos linfócitos. Após 10 minutos de incubação a TA e no escuro foi realizada uma centrifugação a 2000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet lavado duas vezes com solução Fosfato-Borato-Sulfato (PBS) 10% enriquecido com soro bovino fetal (2%) e azida sódica (0,1%) sob centrifugação de 2000 rpm durante 5 minutos. O pellet foi ressuspendido com 500µL de paraformaldeído (0,5%) e as células foram adquiridas para análise imediatamente, ou no máximo até 5 dias se mantidas a 4°C no escuro. A aquisição das células foi realizada no aparelho FACSCalibur™ (Becton & Dickson, San Jose, CA, USA), gentilmente cedido pelo Laboratório de Imunofenotipagem do Hospital Araújo Jorge, Goiânia-Go.

A contagem absoluta dos linfócitos T CD3⁺, T CD4⁺ e T CD8⁺ T foi obtida a partir de uma combinação de resultados de contador hematológico e dos resultados percentuais obtidos com o FACSCalibur™. Os cálculos foram feitos da seguinte maneira:

CD3/µL = nº de linfócitos/µL x CD3(%) 100

CD4/µL = n° de células CD3⁺/µL x CD4(%) 100

CD8/µL = n° de células CD3⁺/µL x CD8(%) 100

onde, o nº de linfócitos/µL foi obtido através do contador hematológico; CD3(%) corresponde ao percentual de células CD3⁺ obtido mediante “janela” ou gate na população linfocitária total; CD4(%) e CD8(%) refere-se ao percentual de células CD4⁺ e CD8⁺, respectivamente, obtido mediante gate na população de células CD3⁺.

80 4.2.3 Quantificação da Viremia Plasmática

A quantificação do RNA do HIV-1foi realizada em transcrito reverso do RNA viral através da técnica de RT-PCR (Amplicor HIV-1Monitor test, versão 1.5; Branchburg - NJ, USA) utilizando-se amostras de plasma – EDTA separadas até 6 horas após a coleta e estocadas a – 80ºC até o momento do teste.

4.2.3.1 Extração e precipitação do RNA viral

200 µL de plasma-EDTA foram utilizados para a extração do RNA viral mediante a lise das partículas virais com um agente caotrópico (Tampão Tris-HCL, Tiocianato de guanidina a 68%, Ditiotreitol a 3% e Glicogênio a 1%) e precipitação do ácido nucleico do HIV-1com álcool isopropílico 100% e etanol 70%.

4.2.3.2 Transcrição reversa do RNA viral

As reações de transcrição reversa do RNA e de amplificação do cDNA por PCR foram efetuadas com enzima termoestável recombinante Thermus thermophilus (rTth pol) DNA Polimerase. Na presença de manganês e sob condições de tampão adequadas (Manganês a 2%, ácido acético, corante de amaranto, azida sódica a 0,05%, Tampão Bicina, Glicerol, Acetato de Potássio) a rTth pol apresenta uma atividade simultânea de transcriptase reversa e de DNA polimerase. Esta propriedade faz com que a transcrição reversa e a amplificação por PCR ocorram na mesma reação. Os iniciadores (biotinilados nas extremidades 5’) utilizados para formar uma cadeia de DNA complementar (cDNA) ao RNA alvo foram SKCC1B e SK145 (detalhes no protocolo do fabricante).

4.2.3.3 Amplificação do DNA proviral

Após transcrição reversa do RNA alvo do HIV-1 , para realizar reação cíclica de amplificação do cDNA dependente da variação de temperatura, utilizamos o termociclador GeneAmp PCR Systems 2400 – Perkin Elmer, Connectcut, USA. Após 31 ciclos a 94ºC, 52ºC e 72^ºC, ocorre amplificação exponencial de fragmentos de DNA de 155 pares de bases (amplicom).

4.2.3.4 Hibridização e Detecção do DNA viral

81 O amplicom do HIV-1foi quimicamente desnaturado por uma solução de Hidróxido de Sódio a 1,6%, EDTA e corante de Amaranto, para formar uma fita simples de DNA.

Alíquotas de 25 µL de amplicom desnaturado foram adicionadas em uma microplaca revestida por sondas oligonucleotídicas específicas para o HIV-1(SK102). Para obter resultados quantitativos, foi realizada a análise de diluições sucessivas do amplicom desnaturado na microplaca.

Posteriormente, à reação de hibridização, o conjugado Avidina-Peroxidase HRP (Horse Radish Power), na presença de peróxido de hidrogênio, agiu sobre o substrato TMB (3,3’, 5,5’- Tetrametilbenzidina) formando um complexo colorido. Para interromper a reação foi utilizado ácido sulfúrico a 4,9 % e a densidade óptica foi medida a 450 nm através do leitor automatizado para microplacas (Behring EL 311 Microplate Reader).

4.2.3.5 Quantificação do RNA viral

O Teste Amplicor 1Monitor test, versão 1.5, quantifica o RNA viral do HIV-1utilizando uma segunda seqüência alvo denominada Padrão de Quantificação do HIV-1(QS) que é adicionada à amostra teste numa concentração conhecida. Este QS é uma molécula de RNA não infecciosa, composta de 233 nucleotídeos e transcrita in vitro, apresentando regiões de ligação aos iniciadores idênticas à seqüência alvo do HIV-1. Dentro dos limites lineares do ensaio (400 – 750.000 cópias/mL), a densidade óptica (DO) total, calculada através do programa AMPLICALC^ (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ, USA), é proporcional à quantidade de RNA do HIV-1presente em cada reação de amplificação por PCR. O cálculo é feito a partir da proporção entre a DO total do HIV-1, a DO total do QS e o número de moléculas de RNA do QS introduzidas que varia de acordo com o lote dos reagentes.

Os resultados obtidos foram expressos em número de cópias/mL e log10 cópias/mL, segundo recomendações do fabricante. Resultados inferiores a 400 cópias/mL foram relatados como “abaixo do limite de detecção do teste” e os valores superiores a 750.000 cópias/mL, como “acima do limite de detecção do teste”. Para análise estatística, para carga viral abaixo de 400 cópias/mL foi atribuído valor arbitrário de 399 cópias/mL.