ENSAIOS QUALITATIVOS (TRIAGEM) PARA RESÍDUOS DE ANTIMICROBIANOS

pública. Os antimicrobianos continuam sendo utilizados por muitos produtores, e permanece o risco de que o leite de algumas vacas apresente resíduos que excedam os níveis de segurança e tolerância, sendo este leite processado ou usado para suprimento alimentar (DAVIDSON & BRANEN, 1993).

Várias mudanças têm sido feitas nas indústrias de laticínios, devido ao potencial de resíduos de medicamentos em leite, e esta evolução foi iniciada pelo aumento na detectabilidade dos métodos de análises (CROUBELS e cols., 1994). Para verificar a presença de antimicrobianos no leite, testes de inibição microbiana (MIC) têm sido empregados (BARRY, 1986; DAVIDSON & BRANEN, 1993).

ANG e cols., (1997), realizaram um estudo comparativo entre métodos utilizando cromatografia líquida e inibição microbiana para determinação de resíduos de amoxicilina e ampicilina em leite. No entanto, de modo geral, estes testes, apesar de serem bastante úteis para procedimentos de triagem (screening), não são seletivos e tampouco permitem obter informações quantitativas.

I.8.1. ENSAIOS QUALITATIVOS (TRIAGEM) PARA RESÍDUOS DE ANTIMICROBIANOS

Como medida inicial, os programas de controle de resíduos de antimicrobianos em alimentos devem incluir métodos de triagem, os quais não deverão exigir investimentos em instrumentos laboratoriais complexos, nem em reagentes ou na capacitação de pessoal a elevados custos. Devem ser eficazes e economicamente viáveis. Os métodos de triagem ou seleção podem ser definidos brevemente como métodos de análise qualitativos ou semiquantitativos que detectam a presença numa espécie em uma matriz de interesse, de um remanescente residual de uma substância em concentração igual ou inferior ao LMR. Um resultado suspeito indica que pode ter sido superado o valor do LMR e a amostra deverá ser analisada

19 novamente através de métodos confirmatórios, fornecendo fundamento para uma eventual ação regulatória.

Ensaios de inibição imunológica ou microbiana são comumente usados para identificar a presença de resíduos antimicrobianos no leite. Ensaios de triagem tradicionais são baseados na inibição do crescimento de microorganismos pela presença dos resíduos de antibióticos presentes na amostra teste. Estes ensaios estão baseados em processos de difusão ou turvação. O crescimento de um organismo indicador, em uma cultura líquida transparente, pode ser seguido monitorando a turvação que aumenta com o tempo. Nos ensaios de difusão, o material a ser analisado difunde por um meio nutriente em base de agar que foi aplicado uniformemente com o microorganismo susceptível. Na incubação, o desenvolvimento de uma zona de inibição de germinação e crescimento indica a presença do antimicrobiano (NIELSEN, 1999). Em testes que empregam discos, o diâmetro da zona de inibição do organismo específico é comparado com o tamanho da zona produzida pela amostra controle. O tamanho da zona de inibição é influenciado por vários fatores, entre esses a densidade do inóculo, profundidade do agar, composição média do agar, tempo de incubação e temperatura (BARRY, 1986; DAVIDSON & BRANEN, 1993).

Os ensaios de triagem para resíduos de antimicrobianos em leite devem ser procedimentos de monitoramento eficiente, simples e rápido (permitindo analisar numerosas amostras). Porém, eles não são específicos e só respondem a resíduos biologicamente ativos que inibem o crescimento do microorganismo. Antes de 1991, o ensaio de disco de Bacillus stearothermophilis (BSDA) era o método oficial para avaliar a presença de resíduos de medicamentos em leite in natura. Desde então, contínuas melhorias nos kits comerciais existentes, assim como desenvolvimento de novos kits de triagem foram realizados e introduzidos no mercado (ver Tabela I.4). Porém, não há nenhum kit ideal atualmente disponível para a detecção de resíduos de antimicrobianos em leite. O teste de triagem para resíduos específicos apresenta limites de detecção que estão muitas vezes acima do nível de tolerância.

O Charm II é um ensaio radioisotópico rápido comumente usado e pode detectar os seguintes grupos de antimicrobianos: beta-lactâmicos, tetraciclinas, macrolídeos, aminoglicosídeos, novobiocinam, sulfonamidas e cloranfenicol. O

20 ensaio é baseado na competição entre uma droga marcada e a droga presente na amostra, para um número limitado de sítios específicos de ligação sobre a superfície das bactérias que são adicionadas na amostra.

Entre as desvantagens dos testes de triagem destacam-se os seguintes aspectos: não permitem identificar o analito que foi responsável pela resposta positiva do ensaio, assim como não permitem obter informações quantitativas, assim como, muitas vezes, somente detectam os antimicrobianos quando as concentrações destes se encontram muito acima dos LMR. Os resultados positivos de um teste de triagem podem ser decorrentes da resposta positiva da presença de um ou mais analitos. A presença de altas quantidades de células somáticas ou secreções naturais na amostra pode resultar em falsos positivos (NIELSEN, 1999).

Tabela I.4 Exemplos de kits de triagem para resíduos de antimicrobianos.

Teste Antimicrobiano detectado

STOP (Swab Test Premises) Beta-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos e macrolídeos CAST (Calf Antibiotic Sulfa Test) Beta-lactâmicos, tetraciclinas,

aminoglicosídeos, macrolídeos e sulfonamidas

FAST (Fast Antibiotic Swab Test) Beta-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos e

sulfonamidas

LAST (Live Animal Swab Test) Beta-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos e macrolídeos, usando

a modificação do teste STOP

Charm AIM, Beta-lactâmicos, sulfonamidas,

tetraciclinas, aminoglicosídeos e Macrolídeos

Charm II Beta-lactâmicos, tetraciclinas,

aminoglicosídeos, macrolídeos, novobiocina, sulfonamidas, espectinomicina e cloranfenicol

SNAP Beta-lactâmicos, tetraciclinas

CITE Sulfonamidas Charm SL, Beta-lactâmicos, tetraciclinas,

Fonte: NIELSEN, 1999.

Recentemente KANG´ETHE e cols., 2005, usando os testes de triagem Charm-AIM e Charm-SL verificaram a contaminação de leite por tetraciclinas e beta-

21 lactâmicos. O teste Charm-AIM permite a detecção de cinco famílias de antimicrobianos; beta-lactâmicos, tetraciclinas, aminoglicosídeos, macrolídeos e sulfonamidas, enquanto o teste Charm-SL possibilita apenas a detecção de resíduos de tetraciclinas e beta-lactâmicos. Os pesquisadores mencionam a alta prevalência de resíduos de antimicrobianos em leite, encontrando resíduos de antibióticos beta- lactâmicos em 11% do leite cru, comercializado no Quênia, África.