Ensaios de Toxicidade

Os ensaios de toxicidade foram realizados em trabalho conjunto com o Prof. Dr. Marco Antonio Stephano no Laboratório de Imunobiológicos e Biofármacos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP.

4.5.1. Preparo da Solução Estoque de Cloridrato de Doxiciclina, Branco Reacional e Amostra

Solução de cloridrato de doxiciclina 2000 µg/mL – pesa-se 0,1 g de cloridrato de doxiciclina e dilui com água destilada em balão volumétrico de 50 mL.

O branco reacional é preparado com 9 mg/L de H2O2 e 25 mg/L de Fe3+ em

200 mL de meio aquoso. Retira-se uma alíquota de 20 mL e adiciona-se a esta

NaOH 0,1M até pH 13 para precipitação do íon Fe3+ _{e neutralização do resíduo de}

H2O2 (~9 mg/L). Esta solução é filtrada em filtro 45µm e o filtrado corrigido o pH para 7,0 com H2SO4 1:5 (v/v).

A amostra de tratamento é preparada através da montagem do meio reacional

contendo 200 mL de solução 100 mg/L de cloridrato de doxiciclina, 25 mg/L de Fe2+

e 611 mg/L de H2O2 em béquer protegido da luz e temperatura interna do meio reacional em 35ºC. Após 240 minutos de reação, retira-se uma alíquota de 20 mL do meio reacional e adiciona-se a esta NaOH 0,1M até pH 13 para precipitação do íon

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Fe3+ _{e neutralização do resíduo de H}

2O2 (~9 mg/L). Esta solução é filtrada em filtro 45 µm e o filtrado corrigido o pH para 7,0 com H2SO4 1:5 (v/v).

Todas as soluções utilizadas foram esterilizadas por filtração (filtro 0,22 µm), em capela de fluxo unidirecional, anterior ao uso das mesmas nos testes.

4.5.2. Teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM)

O teste foi feito de acordo com o protocolo para determinação de CIM (MIC, em inglês) em microplaca, contido no M07-A8 do National Committee for Clinical Laboratory Standards. A cepa sensível a doxiciclina utilizada foi Escherichi coli ATCC 25922. As placas de Petri descartáveis com meio de cultura sólido LB ágar (Luria Bertani ágar, Difco) e o meio líquido LB (Luria Bertani, Difco) foram preparados de acordo com o fabricante, em água deionizada, seguida de esterilização em autoclave e teste de esterilidade antes do uso (ausência de turvação após incubação por 24 h/37°C).

4.5.2.1. Preparo de Soluções e Reagente

- Preparo da solução de antibiótico – A solução antibiótico estoque (1 mg/mL) foi preparada em água purificada tipo I, esterilizada por filtração filtro 0,22 µm) e utilizada após o preparo.

- Preparação da solução padrão de turbidez – Para padronizar a densidade do inoculo foi utilizado padrão de turbidez de BaSO4, equivalente a uma solução padrão 0,5 de McFarland (~ 1 a 2 x108 _{UFC/mL). O padrão foi feito com uma} alíquota de 0,5mL de BaCl2 0.048 mol/L em 99,5 mL de H2SO4 0,18 mol/L, homogeneizando constantemente para manter a suspensão. A densidade deste padrão foi verificada em espectrofotômetro (625 nm) em cubeta de 1 cm de caminho ótico. Para que a solução padrão seja válida, o valor da absorbância deve ser de 0,08 a 0,10, mantendo-se constante até o dia da análise.

4.5.2.2. Preparação do Inóculo e Suspensão Direta

Inicialmente, uma alçada do micro-organismo foi inoculada em placa de Petri com meio LB ágar (18-24 h / 37° C). Dessa placa for am selecionadas colônias isoladas e ressuspensas em 5 mL de solução salina estéril (NaCl 0.9%

peso/volume). A turbidez foi medida (espectrofotômetro - 625 nm) a cada colônia adicionada, sendo a adição interrompida quando o valor da densidade ótica da suspensão bacteriana atingiu o valor da solução padrão de turbidez.

4.5.2.3. Teste de Susceptibilidade ao Antibiótico

A susceptibilidade ao antimicrobiano foi determinada pelo ensaio de microdiluição. Para as diluições de antibiótico, a solução estoque foi diluída para o dobro da concentração desejada na primeira coluna da microplaca de 96 poços. Prosseguiu-se a diluição seriada (100 µL por poço) em meio de cultura LB da primeira a décima coluna, sendo a 11ª o controle de crescimento e a 12ª o controle de esterilidade do meio (Figura 16).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Doxiciclina HCl µg/ml 25 µg/ml 12,5 µg/ml 6,3 µg/ml 3,2 µg/ml 1,6 µg/ml 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml 0,1 µg/ml 0,01 0 0 Doxiciclina HCl µg/ml 25 µg/ml 12,5 µg/ml 6,3 µg/ml 3,2 µg/ml 1,6 µg/ml 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml 0,1 µg/ml 0,01 0 0 Doxiciclina HCl µg/ml 25 µg/ml 12,5 µg/ml 6,3 µg/ml 3,2 µg/ml 1,6 µg/ml 0,8 µg/ml 0,4 µg/ml 0,2 µg/ml 0,1 µg/ml 0,01 0 0 Tratamento 25% 12,5% 6,3% 3,2% 1,6% 0.8% 0.4% 0.2% 0,1% 0,05% 0 0 Tratamento 25% 12,5% 6,3% 3,2% 1,6% 0.8% 0.4% 0.2% 0,1% 0,05% 0 0 Tratamento 25% 12,5% 6,3% 3,2% 1,6% 0.8% 0.4% 0.2% 0,1% 0,05% 0 0 Branco do tratamento 25% 12,5% 6,3% 3,2% 1,6% 0.8% 0.4% 0.2% 0,1% 0,05% 0 0

Figura 16 – Esquema de montagem da placa de CIM.

A suspensão celular com densidade corrigida para 0.5 McFarland foi diluída

em meio de cultura (106 UFC/mL) e colocada 100 µL em cada poço. Em paralelo, foi

conferida a pureza do inoculo incubando uma alíquota da bactéria em ágar junto com o teste.

Todas as diluições do antibiótico, tratamento e branco do tratamento foram feitas utilizando-se meio de cultura LB.

O teste foi então incubado em 37°C/24h e analisado visualmente. A concentração do último poço que não turvou foi considerada a CIM.

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4.5.3. Teste de Citotoxicidade 4.5.3.1. Cultura Celular

A cepa murina utilizada para controle de citotoxicidade foi a L929, ATCC CCL- 1, cultivada em meio Dubecco´s Modified Eagle Medium, low glucose (DMEM) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB). A incubação em garrafas descartáveis de cultura (25 cm3 ou 75 cm3) foi realizada em estufa (5% CO2 / 37ºC), sendo o repique feito a cada 48h.

4.5.3.2. Viabilidade Celular por MTT

O teste de citotoxicidade foi baseado na ISO 10993-5:2009 - Anexo C (International Organization for Standardization, 2009), sendo determinado pelo ensaio de MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). O MTT indica a presença de mitocôndrias ativas e, consequentemente, de viabilidade celular.

Para realização do teste, o cultivo celular foi mantido até o segundo repique. Em seguida, o meio de cultura foi descartado e as células aderentes foram tratadas com solução de tripsina 0,5% / EDTA 0,2% (Sigma) por 15 min/37ºC, descolando o tapete celular. A suspensão celular obtida foi acrescida de DMEM+10%SFB para neutralização da pepsina. As células viáveis foram contadas através de câmara de neubauer, em microscópio, após coloração com azul de tripano (Tripan Blue 0,4%,

Sigma). A concentração celular foi então ajustada com meio DMEM (105 _células/mL)

e distribuídas em microplacas de 96 poços para o teste (100 µL/poço). Após

incubação das microplacas para aderência celular (5% CO2/37ºC/24h), foi retirado o

meio de cultura e adicionado 100 µL por poço dos tratamentos e controles: somente meio de cultura – 100% de viabilidade, etanol 20% - 0% viabilidade, meio de tratamento do antibiótico e água nas proporções das amostras teste. As placas com

os tratamentos foram novamente incubadas (5%CO2/37ºC/24h) para posterior

verificação de viabilidade celular.

Após o tratamento descrito, o meio de cultura dos poços foi descartado e a solução de MTT (1 mg/mL em água purificada tipo I) foi adicionada em cada poço, seguida de nova incubação (37ºC/2h). Em seguida, a solução de MTT foi descartada e 100µL de isopropanol foram adicionados em cada poço para dissolver os cristais

formados nas mitocôndrias. A absorbância foi lida em espectrofotômetro a 570 nm. A viabilidade celular relativa dos tratamentos foi quantificada em porcentagem de absorbância, sendo o controle de crescimento com meio de cultura considerado como 100%.

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