4.1. Cultura de células HepG2
A linha celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2 foi obtida através da American Type Culture Collection (ATCC, No. HB-8065). As células foram mantidas em meio de cultura DMEM/F-12, suplementado com tampão HEPES (25 mM), 15 % de SFBi, 1,5 % de penicilina/estreptomicina e 1 % de fungizona (0,25 mg/ml), em atmosfera húmida com 5 % de CO2, a 37 °C. Todas as soluções de tratamento foram
preparadas em meio de cultura DMEM/F-12 e 2 % de SFBi.
4.2. Ensaio de Citotoxicidade: Ensaio do Vermelho Neutro
As células HepG2 foram cultivadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 104 células/poço a 37 °C e 5 % de CO2, 24 h antes de cada tratamento.
Numa primeira abordagem experimental, as células foram expostas a várias concentrações de quercetina durante 49 h desde 0,1 a 100 µM. Numa segunda abordagem as células foram expostas a concentrações de quercetina deste 1 a 200 µM durante 1 h, e numa terceira abordagem foi efectuada uma exposição a H2O2, 100 µM,
durante 30 min seguida de uma exposição a várias concentrações de quercetina desde 1 µM a 200 µM durante 1 h. Um controlo negativo e de solvente (0,2 % DMSO) foram incluídos em todas as experiências.
O ensaio do vermelho foi efectuado com base no método descrito por Repetto
et al., (2008) com algumas modificações, e os passos principais encontram-se
apresentados na Figura 14. No final do tratamento renovou-se o meio de cultura e adicionou-se 10 µl de solução de VN (0,5 mg/ml) a cada cultura e incubou-se a 37 °C durante 3 h. Após remoção da solução de VN, lavou-se as células 2 vezes com PBS a 37 °C, adicionou-se solução Stop (50:1:49 de etanol absoluto: ácido acético: água) e agitou-se durante 20 min. A quantidade de VN na solução foi medida espectrofotometricamente a 540 nm usando um espectrofotómetro Multiskan Ascent da Thermo Labsystems (Massachusetts, EUA).
A percentagem de viabilidade celular relativa de células tratadas foi calculada assumindo que o valor médio de absorvância do controlo negativo corresponde a 100 % de viabilidade celular, pela fórmula seguinte:
( ) [ ]
[ ] (equação 1)
Os resultados foram expressos como o valor médio de percentagem de viabilidade celular (±EP) de três experiências independentes por condição de tratamento.
Figura 14 – Esquema dos passos principais do ensaio do vermelho neutro em células [Adaptado de
Pinto, 2011].
4.3. Ensaio de Genotoxicidade: Ensaio do Cometa
4.3.1. Tratamento in vitro da linha celular HepG2 e alterações ao procedimento geral do ensaio do cometa
Antes do tratamento as células HepG2 foram distribuídas para uma placa de 24 poços a uma densidade celular de 5 x 104 células/poço, e incubadas a 37 °C, 5 % CO2
durante 24 h. Cada tratamento foi efectuado em duplicado, de forma a contabilizar a potencial variabilidade entre culturas.
As células foram pré-expostas a quercetina a diferentes concentrações (5 µM, 10 µM e 25 µM) durante 47,5 h e depois foram co-expostas a quercetina às mesmas concentrações e a H2O2 a 100 µM durante 30 min de forma a determinar a
Para os ensaios com os extractos dos sedimentos, as células foram pré-expostas a quercetina 10 µM durante 1 hora e depois tratadas simultaneamente, durante 48 horas, com quercetina e os extractos de sedimento nas concentrações que já tinham demonstrado indução de danos oxidativos [entre 50 a 200 mg SEQ/ml dependendo do extracto (Pinto et al., 2014a)]. O controlo positivo, H2O2 a 100 µM durante 30 min, foi
garantido em todas as experiências, assim como o controlo do solvente, 2 % DMSO. No final do tratamento as células foram lavadas com PBS, desagregadas e a suspensão celular foi centrifugada durante 10 min a 1200 rpm, a 4 °C. Foi depois adicionada à suspensão celular 80 µl de agarose de baixo ponto de fusão (1 %), colocaram-se duas gotas desta suspensão em 2 lâminas diferentes e cobriram-se com lamelas (20 x 20 mm). Procedeu-se ao ensaio do cometa em que o tratamento enzimático foi apenas com FPG. Foram analisados 100 nucleóides por tratamento (50 por gel, 2 géis por tratamento). Os resultados foram expressos como o valor médio de percentagem de DNA na cauda (±EP) de três experiências independentes por condição de tratamento.
4.3.2. Ensaio do Cometa - Procedimento geral
O ensaio do cometa foi efectuado com base no método descrito por Collins, (2004) com algumas modificações, e os passos principais encontram-se apresentados na Figura 15. A partir da suspensão celular adicionou-se agarose de baixo ponto de fusão (1 %) e colocaram-se duas gotas desta suspensão em 2 lâminas diferentes e cobriram-se com lamelas (20 x 20 mm). Todas as lâminas usadas foram previamente revestidas com agarose de ponto de fusão normal (1 %). Após solidificação dos microgéis, procedeu-se à lise celular (DMSO 10 % v/v; Triton X-100 1 % v/v; NaCl 2,5 M; Na2EDTA.2H2O 100 mM; Tris-HCl 10 mM; N-laurosilsarcosina 1 % m/v; pH 10)
durante no mínimo 1 hora a 4 °C. No final da lise as lâminas foram lavadas com tampão F (HEPES 40 mM; KCl 100 mM; 0,2 mg/ml de albumina de soro bovino; pH 8), 3 vezes seguidas durante 5 min cada, a 4 °C. Aplicou-se 50 µl de solução enzimática (FPG ou ENDO III em tampão F) ou apenas tampão F por lâmina, e colocou-se de seguida a incubar durante 30 min para a FPG e 45 min para a ENDO III, a 37 °C. Antes da electroforese as lâminas foram incubadas em tampão alcalino de electroforese frio (NaOH 300 mM; Na2EDTA.2H2O 1 mM; pH≈13) durante 40 min para a desnaturação do
frio. No final da corrida as lâminas foram lavadas em tampão de neutralização (Trizma base 0,4 M; HCl 4 M; pH 7,5) durante 10 min, e depois em água destilada durante mais 10 min, a 4 °C. Após secagem, as lâminas foram coradas com BrEt (0,125 mg/ml), e as lâminas foram analisadas num microscópio de fluorescência Axioplan 2 Imaging equipado com uma câmara de alta resolução (ambos do Carl Zeiss Microscopy, Göttingen, Alemanha). Foram contabilizados 100 nucleóides por tratamento através do software Comet Imager 2.2 (MetaSystems, Altlussheim, Alemanha). Utilizou-se como parâmetro de análise a % de DNA na cauda, que está linearmente relacionada com a frequência de quebras no DNA. A diferença entre nucleóides tratados e não tratados com solução enzimática indica a presença de purinas oxidadas, reveladas como quebras pela enzima FPG (sítios sensíveis à FPG) ou presença de pirimidinas oxidadas, reveladas como quebras pela enzima ENDO III (sítios sensíveis à ENDO III).
Figura 15 – Esquema dos passos principais do ensaio do Cometa. - Tratamento enzimático com FPG
ou ENDO III para revelar danos oxidativos no DNA [Adaptado de Pinto, 2011].