Enterococcus sp em alimentos: paradigmas
3. Enterococcus como probióticos
Enterococcus sp. quando presentes em alimentos fermentados,
especialmente queijos 4, embutidos 132 e demais produtos fermentados 44, 50, 52,
contribuem para a ocorrência de características organolépticas desejáveis, relacionadas à consistência, textura e aroma característico 36, 85, 94. Estas
características somadas a resistência ao suco gástrico, a sais biliares e produtores de enterocina 113 tornam este gênero um potencial probiótico 9, 80, 106, 114, 125. Ainda, algumas linhagens probióticos são resistentes a
antimicrobianos. Esta característica favorece sua utilização em combinação com os agentes antimicrobianos.
Probióticos são aditivos que afetam beneficamente o hospedeiro, com diversas propriedades medicinais, incluindo o estímulo do sistema imunológico, redução do colesterol sérico pela ativação do sistema enzimático hepático; aumento da absorção de minerais e vitamina, redução de diarreias e constipação; alívio dos sintomas de intolerância a lactose; contribuição no controle e redução de inflamações, alergias e doenças como o câncer do cólon
7, 54, 112, 117. A influência benéfica dos probióticos sobre a microbiota intestinal
inclui fatores como efeitos antagônicos, competição e efeitos imunológicos, resultando em um aumento da resistência contra patógenos. Assim, a utilização de culturas bacterianas probióticas estimula a multiplicação de bactérias benéficas, em detrimento à proliferação de bactérias potencialmente prejudiciais, reforçando os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro 103.
Diversas preparações farmacêuticas de enterococos probióticos estão no mercado mundial, sendo os mais difundidos: E. faecium SF68® (Cerbios- Pharma AS, Barbengo, Suíça), E. faecalis Symbioflor 1 (SynbioPharm, Herbom, Alemanha)39, BIOTHREE® (Toa Pharmaceutical Co), LEBENIN®-S POWDER
(Wakamoto Co., Ltda), Bioflorin® (Sanova Pharm GesmbH), Medilac®-D.S
(Hanmi Pharmaceutical Co) BIOFERMIN®-R POWDER (Biofermin
Pharmaceutical Co) e Enteronon®-R (Ajinomoto Pharmaceuticals Co) 94.
Em animais, Enterococcus probióticos são utilizados principalmente para tratar ou prevenir a diarreia e melhorar o crescimento durante o manejo. Estudos mostraram eficiência do uso de E. faecium (Cylactin ME 20 Plus ® 50g/T) no controle e redução de Salmonella Minessota quando administrados em frangos. Isolados de E. faecium também foram responsáveis pela redução de Campylobacter jejuni108, Listeria monocytogenes 18 em aves.
Em suínos, a linhagem E. faecium SF68 reduziu a taxa de infecção por
Clamydia 80, 101. Já a linhagem E. faecium NCIMB 10415 reduziu patotipos de
Escherichia coli 8, vírus influenza A 143, coronavirus 16 e vírus entéricos 79. E.
faecium também mostrou-se efetivo contra patógenos de peixes de água
salgada em cativeiro 72.
Em humanos, estudos com linhagens probioticas de Enterococcus têm sido conduzidos no tratamento de diarreia, diarreia associada ao uso de antimicrobianos, síndrome do intestino irritado, redução nos níveis de colesterol e melhora na imunidade do hospedeiro5. Ainda, há trabalhos
relatando o uso concomitante de Enterococcus com outras BALs como alternativa nas estratégias de bioprofilaxia e bio-terapia contra câncer de colon
133. Ainda, E. faecium é capaz de reduzir biofilme formado por Streptococcus
mutans 129.
Cepas probióticas são selecionadas de acordo com as propriedades funcionais e fisiológicas as quais podem ser determinadas in vitro, como resistência a sais biliares, baixo pH, produção de bacteriocinas, autoagregação e coagregação134.
Brandalize (2013) isolou e analisou cepas de Enterococcus sp., provenientes de queijo tipo minas frescal, quanto a sua capacidade probiótica em comparação com cepas probióticas comerciais. Esses isolados apresentaram taxas de sobrevivência superior à cepa controle, quando submetidos a condições de stress de pH e enzimático, semelhantes às condições encontradas no trato digestório. Neste estudo, os autores mostraram o potencial probiótico de Enterococcus sp presentes em alimentos13.
Alguns testes in vitro podem ser usados para determinar a tolerância ao ácido estomacal, porém, é importante ressaltar que os níveis de tolerância a diversos pH variam consideravelmente entre as bactérias probióticas75. Para
que uma bactéria possa ser considerada probiótica, ela deve sobreviver entre os pH 2,0 e 3,0, durante 3 horas53, 56, 96. A presença de sais biliares e
pancreatina no intestino é outra barreira biológica à sobrevivência e colonização do probiótico. O tempo de permanência no trânsito intestinal deve ser de 1 à 4 horas em pH por volta de 8,065.
Os mecanismos de resistência de Enterococcus ao baixo pH se dá pela: homeostase do pH intracellular pelo bomba de próton-ATPase; pelo sistema glutato descarboxilase; alcalinização do meio externo pela usease ou argina desaminase; alteração na densidade celular e mudança ao nível de membrana celular14, 27.
Ainda, a ausência de fatores de virulência e ausência de genes determinantes da resistência aos antimicrobianos estão entre os critérios mais relevantes de seleção de bactérias probióticas para uso humano22, 82, 113, 127.
Um critério definitivo para a seleção de cepas probióticas irá depender da indicação clínica, além de considerações de segurança biológicas, como a capacidade de sobreviver ao trânsito gastrintestinal e a tolerância à acidez e à bile. Adicionalmente, não se pode aceitar o fato de que uma determinada cepa
probiótica será efetiva para todos os indivíduos ou mesmo para um mesmo indivíduo em diferentes fases de uma doença122, por isso da necessidade de
estudar novos isolados com potenciais probióticos.
O potencial probiótico pode diferir até mesmo para diferentes cepas de uma mesma espécie. Cepas de uma mesma espécie podem ser incomparáveis por apresentar áreas de aderência distintas, efeitos imunológicos específicos e mecanismos distintos de ação sobre a mucosa saudável ou com processo inflamatório67.
Para a utilização de culturas probióticas na tecnologia de fabricação de produtos alimentícios, além da seleção de cepas probióticas para uso em humanos, as culturas devem ser empregadas com base no seu desempenho tecnológico. Culturas probióticas com boas propriedades tecnológicas devem apresentar boa multiplicação no substrato, sobrevivência no alimento durante a fabricação do produto e prazo de validade, além de propiciar propriedades sensoriais adequadas no produto e ser estáveis e viáveis durante armazenamento. Desta forma, podem ser manipuladas e incorporadas em produtos alimentícios sem perder a viabilidade e a funcionalidade, resultando em produtos com textura e aroma adequados95, 145. Esses alimentos devem
permanecer com algumas características inalteradas após a adição do micro- organismo para serem considerados probióticos como, por exemplo, conter pelo menos 107 UFC/g de bactérias probióticas viáveis111, 139. Entretanto,
vários autores propõem que a dose mínima diária da cultura probiótica considerada terapêutica seja de 108 e 109 UFC/g ou mL 63, 83.
Os mecanismos de ação dos probióticos estão relacionados à competição por sítios de ligação ou à exclusão competitiva, ou seja, as bactérias probióticas ocupam o sítio de ligação na mucosa intestinal formando, uma barreira física às bactérias patogênicas. Assim, as bactérias seriam excluídas por competição de espaço, sendo, as fímbrias os elementos de aderência bacteriana mais conhecidos e estudados. São estruturas compostos por fosfoglicoproteínas que se projetam do corpo bacteriano, e seus receptores são específicos e se diferem entre as porções anatômicas, ao longo do trato intestinal73.
As ligações específicas entre o epitélio intestinal humano e Enterococcus são vinculadas à substância de agregação (Agg). Essa substância é uma proteína de superfície codificada e expressa em resposta a indução por ferormônios. A Agg converte a superfície celular bacteriana em uma superfície
aderente para as células, causando agregação ou aglutinação, facilitando a adesão na matriz das células eucarióticas69, 77, 87.
A auto-agregação pode ser definida como a aderência de bactérias que pertencem a mesma espécie e co-agregação ocorrem quando duas ou mais bactérias, de espécies diferentes, interagem formando um agregado composto estável e este último é altamente específico e pode ser considerado um fator de virulência71. A auto-agregação de micro-organismos é um importante requisito
para que os mesmos possam fazer parte da microbiota intestinal 21, 29, 141, 142.
Ainda, a tolerância ao fenol é desejável, já que este composto pode ser formado no intestino pela desaminação de aminoácidos aromáticos provenientes da dieta ou de proteínas endógenas 99,120.
Segundo Charteris et al (1998) as metodologias in vitro representam uma importante forma de caracterização dessa capacidade, pois, além de garantir resultados confiáveis, são executadas com maior facilidade que os estudos in vivo17. Contudo, os probióticos devem, necessariamente, resultar
em efeitos benéficos mensuráveis sobre a saúde, substanciados por estudos conduzidos no hospedeiro ao qual ele se destina. Em outras palavras, probióticos destinados para o uso em humanos requerem comprovação da eficácia em ensaios em humanos116.
Alguns autores relatam que o isolamento de Enterococcus de determinados alimentos tem potencial uso probiotico naquele alimento, pelo fato das células já estarem adaptadas ao produto. As espécies mais frequentemente isoladas em produtos lácteos são E. faecalis, E. faecium e E.
durans. Estas são capazes de crescer em ambientes restritos, de elevado teor
salino e baixo pH, como os encontrados em queijos, ao passo que demais BALs dificilmente se desenvolveriam sob tais condições58.