Entomopatogenicidade de Bacillus thuringiensis

As propriedades inseticidas dos cristais de proteínas produzidos por Bt foram reveladas ao serem encontrados esporos e cristais em lagartas mortas da traça-da-farinha, e no instante em que se observou que essas lagartas, quando em contato direto com os esporos/cristais, não apresentavam qualquer sintoma; porém quando as folhas revestidas com essa mistura eram ingeridas, as lagartas cessavam a alimentação e morriam (Sanahuja et al., 2011).

Na atualidade, sabe-se que as toxinas e inclusões de proteínas produzidas podem apresentar toxicidade específica para espécies de diversas ordens de insetos como Lepidóptera, Coleóptera, Díptera, Homoptera, Hymenoptera, Mallophaga; apresentando também atividade contra espécies de nematoides e outros invertebrados (De Maagd et al. 2003; Kotze et al., 2005; Grossi-De-Sá et

al., 2007; Bravo e Soberon, 2008). A variabilidade das toxinas Cry conhecidas

função da toxina, sua especificidade ao inseto alvo (Pigott e Ellar, 2007) e seu mecanismo de ação.

As proteínas Cry são produzidas na forma inativa (protoxinas) e posteriormente à ingestão pela larva do inseto suscetível, o cristal de proteína é solubilizado ao entrar em contato com o pH alcalino do intestino (Figura 5). Após o passo de solubilização, as protoxinas são ativadas pela ação de proteases intestinais que irão produzir a forma ativa das toxinas. Estas toxinas ligam-se a receptores locais de alta afinidade que estão presentes na superfície das células epiteliais do intestino médio e que possibilitam a formação de poros nas membranas, causando a destruição das células (Knaak et al., 2010).

Figura 5: Esquema da ação das toxinas Cry. (Figuras USDA, GMO Safety; Embrapa)

O mecanismo de ação é bem caracterizado. Tem início no momento da solubilização dos cristais de protoxinas em pH alcalino, sendo portanto necessário que os cristais encontrem um ambiente redutor e assim ocorra a ruptura das

pontes dissulfeto localizadas na porção C-terminal das proteínas Cry. As condições necessárias para o início do mecanismo como descrito anteriormente, são normalmente observadas no intestino médio de larvas de inseto, tornando-os suscetível às toxinas (Knowles, 1994).

Uma vez em contato com o pH alcalino e estando sob ação de enzimas proteolíticas, as protoxinas são clivadas e liberam a porção N-terminal ativa e em seguida se ligam a receptores que as mantém presas à membrana. Logo após a interação entre toxina e receptor, observa-se uma mudança conformacional da molécula, permitindo sua inserção no epitélio e promovendo a formação de oligômeros de toxinas e poros na membrana (Delécluse et al., 2000).

Segundo Knowles (1994), as toxinas ativas proporcionam um aumento da absorção da glicose, iniciando os sintomas histopatológicos que podem ser observados no intervalo entre 1 e 5 minutos após a ingestão. Após este curto período, observa-se a paralisia do intestino médio, aumento do pH da hemolinfa e redução do pH do lúmen (intervalo de 5 à10 minutos); posteriormente verifica-se o aumento do fluxo e concentração de K+ da hemolinfa, colapso metabólico celular (intervalo de 10 à 30 minutos), lise celular e ruptura da membrana basal. Entre uma e sete horas ocorre a paralisia geral, com consequente morte por falta de alimento ou septicemia sendo observada entre um e três dias.

As etapas descritas anteriormente são comuns aos dois modelos atualmente aceitos para explicar o mecanismo de ação das toxinas Cry. O mais antigo modelo de ação é denominado “formação de poros” e parece ser o mais comum entre as ordens Diptera, Lepidoptera e Coleoptera. Esse modelo explica que a ligação da toxina com os receptores específicos provoca a formação de oligômeros de toxinas que se ligam a receptores secundários da membrana da

célula intestinal, culminando com a inserção da toxina oligomérica na membrana das células epiteliais do intestino, resultando na formação dos poros (Bravo et al., 2007; Bravo e Soberón, 2008).

No modelo de “transdução de sinal” (o mais recente dos modelos), explica que a proteína Cry se liga com receptores específicos induzindo várias reações intracelulares. Estas reações envolveriam a proteína G e a adenilato ciclase aumentando a concentração de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) intracelular e consequentemente ativando a proteína quinase; danificando a célula pelo desequilíbrio de pressão interna (Bravo e Soberón, 2008). Independente do modelo, a ação da toxina paralisa o aparelho digestório ocasionando a morte do inseto (Bravo e Saberón, 2008; Vallete-Gell et al., 2008).

O mecanismo de ação das proteínas Cyt é semelhante ao das proteínas Cry, começando pela síntese como protoxinas e com posterior remoção de pequenas porções nas extremidades N e C-terminais (Gill et al., 1987; Li et al., 1996), porém estas não se ligam com receptores de proteínas; interagindo diretamente com a membrana lipídica para a formação dos poros (Li et al., 1996; Promdonkoy e Ellar, 2003). Segundo De Maagd et al., (2003), a principal ação das proteínas Cyt é contra insetos da ordem Diptera e alguns trabalhos têm apresentado resultados que comprovam uma sinergia entre tipos de proteínas Cry e Cyt (Pérez et al., 2005).

As Vip proteínas são secretadas durante o crescimento bacteriano que se dá antes da fase de esporulação, não sendo verificada homologia entre suas sequências com sequências das δ-endotoxinas (Cry e Cyt) (Estruch et al., 1996; Mahon et al., 2012). Os estudos sobre o mecanismo de ação de membros das classes das proteínas Vip apontam que, assim como as proteínas Cry, a atividade

é iniciada no epitélio intestinal; no entanto, apresentam a vantagem de se ligarem mais rapidamente aos receptores de membranas das células do epitélio, começando uma degeneração progressiva (Yu et al., 1997, 2011). As proteínas Vip apresentam ação tóxica específica para insetos da ordem Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera (Estruch et al., 1996; Warren, 1997; Sattar et al., 2008).

Algumas cepas de Bt são responsáveis pela produção de uma exotóxina termoestável chamada de β-exotoxina ou também denominada como thuringiensina. Sabe-se que esta exotoxina é secretada no meio de cultura quando se inicia o processo de esporulação, sendo considerado um análogo nucleotídico de DNA e apresentando peso molecular de 701 Daltons. Esta toxina tem demonstrado ação tóxica a insetos das ordens dos Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros, Hemípteros e também a outros grupos como os protozoários, platelmintos e nematódeos (Hernández et al., 2003). A thuringiensina atua principalmente na inibição da RNA polimerase por competir pelo ATP gerando danos na formação dos fusos mitóticos, apresentando então efeitos teratogênicos e mutagênicos (Hansen e Salamitou, 2000).