Envolvimento de eIF5A com tradução e expressão gênica diferencial num mutante deste fator

Desde de sua identificação inicial, foi atribuído a eIF5A um papel no início da tradução (Benne e cols., 1978). No entanto, a não confirmação desta proteína como um fator importante de maneira geral para a tradução levou à proposta de que eIF5A poderia estar envolvido com o processo de tradução de um grupo específico de mRNAs (Benne e Hershey, 1978; Kang e Hershey, 1994).

Foi possível verificar neste trabalho que eIF5A associa-se fisicamente a partículas ribossomais 80S (monossomos) envolvidos com o processo de tradução. Além desta associação se mostrar específica, uma vez que ela é dependente da tradução, os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 de eIF5A mostraram defeitos na distribuição polissomal, quando comparados ao alelo selvagem na temperatura não permissiva. Curiosamente, o defeito mostrado pelos mutantes de eIF5A não se assemelha aos defeitos mostrados por outros mutantes de início de tradução, mas sim a um mutante envolvido com o processo de elongação da tradução (Greenberg e cols., 1998; Peltz e cols., 1992). De maneira bastante interessante, foi descrito em nosso laboratório recentemente a interação física de eIF5A com proteínas da subunidade maior do ribossomo e o fator de elongação da tradução eEF2 (Gregio, A.P.; Lustri, W.R.; Maragno, A.L.; Mestriner, C.A.; Pandolfi, J.R., dados não publicados). Além disso, dados de interação de eIF5A com subunidade 80S e associação com perfil polissomal também foram mostrados recentemente (Jao e Chen, 2006). Entretanto, a adição de eIF5A não levou a nenhum aumento da polimerização in vitro de poli-fenilalanina, utilizando-se um sistema de síntese protéica purificado (Benne e Hershey, 1978). Desta maneira, novos estudos deverão

ser conduzidos para se entender o papel da associação de eIF5A com a maquinaria de tradução.

Na intuito de descobrir quais mRNAs se mostravam diferencialmente associados com as frações polissomais no mutante tif51A-1 na temperatura restritiva com relação ao selvagem, foi realizada a caracterização do perfil traducional desse mutante. Os resultados mostraram que existe uma série de genes diferencialmente associados à maquinaria de tradução no mutante tif51A-1 na temperatura restritiva tanto de maneira reduzida, como aumentada. Estes resultados mostram a redução de transcritos envolvidos com o processo de transporte nucleocitoplasmático e metabolismo de ácido carboxílicos. Um fato bastante interessante é que genes envolvidos com o metabolismo de ácidos carboxílicos aparecem aumentados na análise do conteúdo total de mRNAs do mutante tif51A-1 na temperatura restritiva (Anexo IV), reforçando o dado de que estes genes são diferencialmente traduzidos nestas condições. O aparecimento de genes envolvidos com transporte nucleocitoplasmático (NMD5, KAP95, SXM1, SRP1 e PSE1) pode vir a compor um novo mecanismo de controle deste transporte. Além desses genes selecionados com esta função de trânsito nuclear, outros três genes, que não entraram nessa categoria de “protein carrier activity”, mas que também estão envolvidos com transporte nucleocitoplasmático, KAP104, NUP120 e GSP1, também apresentaram menor associação com as frações polissomais do mutante tif51A-1 na temperatura restritiva.

Com relação aos transcritos cuja associação com os polissomos foi aumentada no mutante tif51A-1 com relação ao selvagem na temperatura restritiva, foram identificados genes envolvidos com o transporte de vesículas (Tabela 10). Além disso, um dos componentes celulares cujos genes se mostraram reduzidos na

análise do conteúdo total de mRNAs foi o retículo endoplasmático (Anexo III). Esses dados são interessantes, pois o mutante tif51A-1 é suprimido em alto número de cópias pelos genes MSB3 e MSB4, envolvidos na etapa final de fusão de vesículas com a membrana celular, e um mutante do gene YPT1, envolvido com transporte do retículo endoplasmático para Golgi, foi isolado como letal sintético do alelo tif51A-1 (Frigieri, M.C. e Zanelli, C.F., dados não publicados).

Por fim, é também importante ressaltar que uma série de genes envolvidos com brotamento e polarização do citoesqueleto de actina foram identificados como aumentados no mutante tif51A-1 (Anexo IV). Curiosamente, genes envolvidos com estes mesmos processos são capazes de suprimir o defeito de sensibilidade a temperatura deste mutante quando presentes em alto número de cópias (Tabela 4 e Figura 18), e mutantes de eIF5A apresentam defeitos da polarização do citoesqueleto de actina (Figura 13). O fato de estes transcritos estarem aumentados no mutante tif51A-1 pode indicar a resposta celular a um defeito de ciclo celular ou pode indicar uma estabilização dos mesmos devido à inibição do processo de elongação da tradução, o que estaria de acordo com os dados observados para um papel de eIF5A na tradução.

Apesar dos resultados interessantes e das diferentes possibilidades a serem analisadas obtidos a partir do perfil traducional, a hipótese de regulação da tradução de mRNAs diretamente relacionados à transição G1/S do ciclo celular não se confirmou com esta análise. Entretanto, mesmo que não significativamente selecionados pela análise de ontologia genética, uma série de genes relacionados a ciclo celular (REC102, ADY2, KAP104, UBC9, TUB2, ACT1, TAF11, ZPR1, TOP3,

CYR1, DMA1, KCC4, FUS3, SGS1), brotamento (SLA2, ACT1, CDC11, BUD2, KCC4 e SEC3) e estabelecimento de polaridade celular (YOR300W, PWP2, MSB2,

SLA2, ACT1, CDC11, BUD2, KCC4 e SEC3) apareceram significativamente

reduzidos no perfil traducional e a relevância do seu aparecimento deverá ser estudada futuramente.

6. CONCLUSÕES

6.1. A supressão em alto número de cópias do mutante tif51A-1 de eIF5A por PKC1 é independente da via de MAP quinases.

6.2. ZDS1 e GIC1 são supressores do mutante tif51A-1, juntamente com outros genes envolvidos com transição G1/S do ciclo celular em S. cerevisiae.

6.3. Mutantes de eIF5A possuem defeito na polarização de actina, o que sugere uma função de eIF5A na transição G1/S do ciclo celular em S. cerevisiae.

6.4. A supressão do mutante de eIF5A por PKC1 é dependente de uma nova via de sinalização abaixo de Pkc1, que envolve Zds1/Zds2 e Gic1.

6.5. eIF5A associa-se a partículas ribossomais de maneira dependente à tradução.

6.6. Mutantes de eIF5A apresentam alterações de perfil polissomal, sugerindo defeitos no processo de elongação da tradução.

6.7. O mutante tif51A-1, na temperatura restritiva, com relação ao selvagem, apresenta na fração polissomal uma diminuição de transcritos envolvidos com transporte nucleocitoplasmático e ácidos carboxílicos e um aumento de transcritos envolvidos com transporte vesicular.