Enzimas Antioxidantes 1 Preparo das amostras

A determinação da atividade de enzimas antioxidantes foi realizada em sobrenadante de um homogenato preparado a partir do fígado dos animais. O protocolo para o preparo do homogenato foi baseado em um estudo prévio (RAMOS-VASCONCELOS, HERMES- LIMA, 2003). De cada animal pesou-se aproximadamente 100 mg de fígado e adicionou 1 ml de tampão gelado (fosfato de potássio 50 mM e EDTA 0,5 mM, pH=7,2). Na hora da homogeneização 10 µmol de PMSF (solução estoque a 1mM) foi incorporado ao microtubo, afim de evitar a degradação das enzimas. As amostras foram então homogeneizadas durante 1 minuto e colocadas no gelo por 30 segundos. Esse procedimento foi repetido três vezes. Logo após esse processo, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 4°C em 10000 RPM. O sobrenadante foi então coletado e armazenado para a dosagem de proteínas totais, atividade da CAT, GPx e SOD.

5.7.2. Proteínas totais

As proteínas totais do homogenato de fígado foram quantificadas segundo o método de Bradford (1976) (BRADFORD, 1976). Este ensaio tem como base o reagente Coomassie

Blue G-250 e utiliza a albumina bovina sérica como padrão. A ligação das proteínas ao

reagente altera a coloração do ensaio, passando de castanho para tons de azul, de acordo com a concentração de proteínas. Primeiramente, foi preparado o reagente Coomassie Blue G-250 (0,01%) em 4,7% de etanol (p/v) e 85% ácido ortofósforico (p/v). Após dissolução completa do corante, foi adicionado quantidade suficiente para 1 L de solução com água destilada. A solução foi filtrada e armazenada em vidro âmbar. A albumina bovina sérica (BSA) utilizada como padrão, foi preparada inicialmente a 2,0 mg/ml. A partir dessa solução, diferentes diluições foram realizadas com concentrações variando entre 0,2 e 1,4 mg/ml de BSA. As amostras precisaram ser diluídas em água destilada (1:20). Em uma microplaca foram pipetados 10 µl de amostra diluída ou série de padrões e 190 µl do reagente Coomassie Blue. A microplaca foi incubada a 3 min e então foi realizado a leitura a 595nm. O branco da reação continha apenas Coomassie Blue. Todas os ensaios foram realizados em duplicata.

Os valores de proteínas foram determinados a partir da construção de uma curva padrão utilizando os valores de absorbância dos padrões e as concentrações de BSA. Os valores foram expressos em mg/ml.

5.7.3. Atividade da Catalase

A atividade da enzima CAT foi determinada baseando-se no método proposto por Aebi (AEBI, 1984). Em resumo, a capacidade antioxidante da enzima é avaliada de maneira cinética em espectrofotometria, através do monitoramento da decomposição do H2O2 durante

2 minutos a 240nm.

Primeiramente, foi preparada uma solução de H2O2 300mM em água destilada. Em

um tubo de ensaio foi adicionado 955 µl do tampão e 10 µl da amostra diluída (1:20). Logo em seguida, adicionou-se 35 µl da solução de H2O2 300mM. O conteúdo foi transferido

imediatamente para uma cubeta de quartzo e realizou-se a leitura a 240 nm durante 2 minutos, medindo a absorbância a cada 30 segundos. O delta foi obtido pela média da subtração do valor de absorbância inicial pelo final, e o resultado foi obtido através da fórmula:

Atividade (U/L) =

Sendo:

∆Abs = Variação da absorbância por 1 minuto de cinética enzimática linear

∆t = 1 minuto

εH2O2 (240 nm) = 40 L.mmol-1.cm-1

VT = Volume total de reação

VA = Volume de amostra

1000 = Conversão de mmol para µmol (de acordo com a definição de atividade enzimática)

20 = Fator de diluição da amostra no procedimento

5.7.4. Atividade da Glutationa Peroxidase

A GPx tem uma ação não específica sobre o peróxido de hidrogênio, atuando também sobre vários substratos, como os hidroperóxidos orgânicos. A GPx catalisa a reação de hidroperóxidos com glutationa reduzida (GSH) para formar glutationa oxidada (GSSG) e o produto de redução do hidroperóxido. Fisiologicamente, a GPx atua acoplada à enzima glutationa redutase (GR) que, por sua vez, catalisa a redução de GSSG, usando NADPH como coenzima. A atividade da GPx pode ser medida pela taxa de oxidação de NADPH na presença de GSH e GR. A azida sódica (N3Na) é adicionada para inibir a catalase.

Em tubos de ensaio foi adicionado 82,5 µl de tampão fosfato 143 mM pH 7,5 EDTA 1mM, 125 µl de NADPH (0,29 mM), 5 µl azida sódica (100 mM), 12,5 µl de GSH (20 mM, diluída em ácido ortofosfórico 5%), 2,5 µl de GR (10 U/mL), 2,5 µl de KCN (9 mM) e 12,5 µl de hidroperóxido de tert-butil (10 mM). O conteúdo foi homogeneizado e adicionou-se em seguida, 5 µl de amostra diluída (1:20). A leitura foi realizada rapidamente em espectrofotômetro a 340 nm. Os valores de absorbância inicial e após 1 minuto, foram anotados para cálculo da atividade de GPx.

Atividade (U/L) =

Sendo:

∆ Abs = Variação DA absorbância por 1 minuto de cinética enzimática linear

∆t = 1 minuto

εNADPH = 6,22 L.mmol-1.cm-1

VT = Volume total de reação (µL)

VA = Volume de amostra (µL)

103 = Conversão de mmol para µmol (conforme definição de U.L-1)

20 = fator de diluição

5.7.5. Atividade da Superóxido Dismutase

O ensaio para determinação da atividade da enzima SOD foi realizado a partir do método proposto por Madesh e Balasubramanian (MADESH, BALASUBRAMANIAN, 1998). A metodologia tem como base a capacidade da enzima em neutralizar o ânion superóxido (O 2•-) produzido pela oxidação do pirogalol. O corante MTT [3-(4,5-dimetil- tiazol-2-il) 2,5-difenil tetrazólio brometo] é reduzido a cristais de formazan em reação dependente de O2 •- produzindo um composto de cor arroxeada medido através de espectrofotometria. Por meio da quantificação em unidades relativas, é possível determinar a capacidade de uma unidade de atividade enzimática (1U) da SOD em inibir a redução do MTT, é igual a 50%.

Em uma microplaca de 96 poços, foi adicionado 30 µl das amostras diluídas (1:20) e 99 µl do tampão fosfato de potássio 50 mM e EDTA 0,5 mM (descrito anteriormente). Para os poços contendo o branco e o padrão, o volume do tampão foi calculado para obtenção de um volume final de 150 µl por poço. Por conseguinte, acrescentou-se em todos os poços 6 µl de MTT (1,2 mM diluído no tampão), seguido de 15µl de pirogalol (15 mM diluído no tampão), em todos os poços, exceto no branco. Após esses procedimentos, a placa foi incubada em estufa com temperatura de 37°C durante 5 minutos. Logo em seguida foi adicionado 150 µl de dimetil sulfóxido (DMSO) P.A. em todos os poços para promover a parada das reações e solubilização dos cristais formados. Os valores das absorbâncias foram lidos em espectrofotômetro de microplacas a 570nm. Os resultados foram expressos em U de SOD por mg de proteínas totais.

5.8. Marcadores do Estresse oxidativo