Equipamentos utilizados para análise das amostras

As observações e ilustrações foram obtidas a partir de uma câmara digital Leica DFC 320 acoplada a um microscópio Leica DM 5000.

7.4.4 Método

Cortes transversais foram feitos a mão livre e transferidos por meio de um pincel de ponta fina, para um vidro de relógio contendo água deionizada, para preservação do tecido. Posteriormente, estes foram selecionados, utilizando lupa, visando selecionar os cortes mais finos e com orientação correta. Após seleção dos cortes, parte destes, foi mantida sem coloração, com o intuito de atuar como branco, e a outra parte foi submetida à diferentes reagentes, visando à detecção das diferentes classes de metabólitos secundários previamente isolados das raízes de Maytenus ilicifolia. Para a realização dos testes histoquímicos foram utilizados os seguintes reagentes: Sudan III para substâncias lipofílicas, Dragendorff para alcalóides, Cloreto férrico para compostos fenólicos. Após seleção, os cortes foram transferidos para vidros de relógio adicionando-se sobre eles os diferentes reagentes. Em seguida, os cortes foram montados entre lâmina e lamínula e analisados em microscópio.

7.5 Resultados e Discussão

A análise das seções anatômicas evidenciou que as raízes se encontram em estrutura secundária, sendo possível visualizar os seguintes tecidos: xilema secundário, floema secundário, córtex e periderme.

Em quase todas as lâminas foi possível visualizar um enorme número de células contendo grãos de amido. As células parenquimáticas corticais e todas as células do xilema secundário (elemento de vaso, parenquimática e fibra) apresentaram muitos grãos de amido (Figura 134, p. 193).

O amido (homoglicano) é acumulado em plantas sendo a principal fonte de reserva nos tecidos parenquimatosos. A celulose é o composto orgânico

abundante na terra, parte constitutiva das paredes celulares da célula vegetal (Carvalho e Ribeiro.; 2006). Pe Co Fl Xi A B

Figura 134 - Fotomicrografias de cortes transversais da raiz de M. ilicifolia. A- Raiz,

mostrando grãos de amido (em preto) no xilema secundário (Xi), floema secundário (Fl), córtex (Co) e periderme (Pe), estrutura secundária. B- destaque (em preto) de

grãos de amido no xilema secundário. Escalas: A= 100Pm e B=50Pm

Os terpenos (Figura 135, p. 194) foram evidenciados majoritariamente nas células do súber. Apresentaram coloração natural amarela e aparência lisa. Ocupam todo o citoplasma da célula. Ocorrem também em algumas células do córtex e do xilema secundário.

Su Xi Co A B C D E

Figura 135 - Fotomicrografias de cortes transversais da raiz de M. ilicifolia. A- Raiz,

mostrando terpenos (em amarelo-alaranjado ou vermelho) no súber (Su), sem uso de ragente, B e C- com uso de reagente, D e E- mostrando terpenos no córtex (Co) e no xilema secundário (Xi), sem uso de reagente. Escalas: A, B= 50Pm e C, D e E=100Pm

Os alcalóides foram observados nas células do córtex, do xilema secundário (fibras) e do súber (Figura 136, p. 195). Ocupam o citoplasma celular e possuem aparência granulosa.

Os alcalóides podem ser localizados sob a forma de sais orgânicos, nos tecidos externos de raízes e caules, nas epidermes, tricomas, no mesofilo das folhas, no tegumento das sementes e nos canais secretores. Esses compostos apresentam distribuição restrita nos vegetais e embora sua atuação não seja bem compreendida, sabe-se que os alcalóides constituem um grupo importante na defesa contra herbívoros por seu sabor amargo. Os alcalóides apresentam amplo espectro de atividades biológicas, como por exemplo, atividade antitumoral e anti-hipertensiva.

A _B Xi Su Co Su Co

Figura 136 - Fotomicrografias de cortes transversais da raiz de M. ilicifolia. A e B-

Raiz, mostrando alcalóides (castanho escuro) no súber (Su), córtex (Co) e no xilema secundário (Xi). Escalas: A e B= 100Pm

Os compostos fenólicos (Figura 137, p. 195) foram observados no córtex, após coloração com cloreto férrico. Os testes para compostos fenólicos são, de um modo geral, poucos específicos, havendo compostos como os flavonóides que, na maioria das vezes, são detectáveis senão em microscopia de fluorescência em luz ultravioleta.

Co

Figura 137 - Fotomicrografias de cortes transversais da raiz de M. ilicifolia. Raiz,

mostrando compostos fenólicos (negro azulada) córtex (Co). Escala: 100Pm

A fluorescência é um fenômeno óptico no qual a luz é absorvida por uma substância chamada fluoróforo e quase instantaneamente re-emitida com luz

moléculas de fluoróforo tornam-se excitadas, quer dizer, absorvem a energia da luz e passa a um estado excitado no qual a energia de cada molécula é maior do que o seu estado fundamental.

A energia excedente é dissipada em calor, emitida em fluorescência, ou usada numa reação fotoquímica.

Esta técnica não é só utilizada quando se pretende detectar substâncias em concentrações mínimas, mas também se usa para observações depois de tratamentos químicos. Quando surgem mudanças nos processos de excitação e/ou emissão de energia devido à sua união ao substrato, também se podem obter informações a respeito da conformação das moléculas do substrato.

A autofluorescência é predominante nos tecidos vegetais. Nos tecidos animais, pode-se encontrá-la nas fibras do tecido conjuntivo (colágeno e elastina). No interior celular, a maior parte da autofluorescência é devida à presença do NADH unido a uma deidrogenase mitocondrial.

A detecção de células autofluorescêntes foi monitorada por microscópia de epifluorescência, sendo selecionado comprimento de onda no vermelho.

A autofluorescência dos triterpenos foi observada no súber e os compostos fenólicos foram observados nas paredes de algumas células do córtex (imagem de fluorescência, Figura 138, p. 196).

A B

Figura 138 - Caracterização histoquímica por cortes transversais por epifluorescência

da raiz de M. ilicifolia. A – triterpenos localizados no súber e B- compostos fenólicos no córtex. Escala: 100Pm

Os testes histoquímicos indicaram que as raízes apresentaram células com compostos de natureza química diversificada onde estão incluídos os terpenos, os alcalóides e os compostos fenólicos. A ocorrência dos triterpenos quinonametídeos e dos alcalóides piridínicos sesquiterpênicos corroboram o caráter quimiotaxonômico da família em estudo. Estes metabólitos secundários são compostos restritos ao órgão em estudo, podendo-se inferir que o estudo histoquímico confirmou a presença das duas principais classes de metabólitos secundários comumente encontrados nesta espécie.

A presença de triterpenos, alcalóides e compostos fenólicos em M. ilicifolia não está associada ás estruturas especializadas na produção e secreção de metabólitos secundários, mas sim a células não especializadas.

7.6 Conclusões

O estudo histoquímico permitiu a visualização e identificação de células autofluorescentes, o que forneceu subsídios para a identificação de diferentes classes de metabólitos secundários nos tecidos e nas células da espécie estudada. Esta análise é pioneira em espécies de Celastraceae e contribuiu sobremaneira aos estudos químicos e biossintéticos, uma vez que os metabólitos especiais presentes nas espécies estudadas apresentam-se compartimentalizados e são dependentes do ciclo de vida da planta. Estes estudos corroboraram a compartimentalização desses metabólitos, que, associado com a química, fornece indícios para os estudos biossintéticos, principalmente relacionados aos aspectos proteômicos. Portanto, a localização majoritária dos terpenos nas células do súber contribuiu para o planejamento e protocolos de extração enzimática, uma vez que evidenciou que esta classe de compostos está localizada nas células da parte externa das raízes. Tal evidencia possibilitou dar continuidade aos estudos proteômicos, uma vez que a parte interna das raízes (córtex) é de difícil acesso devido sua rigidez.

8- Estudo Biossintético