Escolha do gene de referência para análise da expressão gênica por

por qPCR na glândula de veneno de Bothrops jararaca.

Poucos trabalhos utilizam o PCR quantitativo em tempo real para a análise de expressão gênica de glândula de veneno de serpentes, portanto foi necessário determinar experimentalmente qual gene poderia ser usado como controle nos experimentos de qPCR, os candidatos foram escolhidos entre os genes mais usados em trabalhos de qPCR em células de mamíferos (beta actina, beta-2-microglobulina, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, hidroximetilbilano sintase, hipoxantina fosforibosil transferase I, proteína ribossomal L13a, succinato desidrogenase subunidade A, proteína de ligação ao TATA box, Ubiquitina C, tirosina 3-monooxigenase/triptofano 5-monooxigenase proteína de ativação, polipeptídeo zeta). Foi feita uma busca no banco de dados de ESTs do laboratório e do NCBI por ESTs de Bothrops jararaca que apresentassem alta similaridade aos genes candidatos.

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transcriptoma da B.jararaca (CIDADE et al.,2006) que apresentaram alta similariade ao gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), n° acesso no genbank DW713269.1, à tirosina 3-monooxigenase/triptofano 5-monooxigenase proteína de ativação, polipeptídeo zeta (YWHAZ), n° de acesso no genbank DW712942.1 e à Ubiquitina C (UBC), n° de acesso no genbank DW713811.1, também foi encontrada uma sequência de Lachesis muta similar a beta-actina (ACTB), n° acesso no genbank DY403299.1. Como o gênero Lachesis pertence a mesma família do gênero Bothrops e a beta-actina é um gene muito conservado mesmo entre espécies distantes, decidiu-se utilizar a sequência encontrada como base para construção dos oligonucleotídeos iniciadores.

Para a construção dos oligos utilizou-se a ferramenta Primer-Blast do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Essa ferramenta permite construir oligos específicos, pois compara as sequências sugeridas às sequências depositadas em seu banco de dados, diminuindo assim a chance de amplificações inespecíficas.

Para confirmar se o oligo estava amplificando de forma específica foi realizada uma reação de PCR simples.

Nas figuras 46 e 47 pode-se verificar que a reação de PCR gerou um único amplicon e do tamanho esperado.

Figura 46: Eletroforese de DNA em gel de agarose 1.β% da reação de PCR da -actina. Marcador de 100pb (Invitrogen) (a). fragmento de 6γpb de -actina (b) e (c) . oligos (d).

a b c d

100pb Fragmento de

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Figura 47: Eletroforese de DNA em gel de agarose 1.2% da reação de PCR de GAPDH, Ubiquitina C e YWHAZ. Marcador de 25 pb (Invitrogen) (a). Fragmento de 77pb de GAPDH (b). Fragmento de 60pb de Ubiquitina C (c). Fragmento de 76pb de YWHAZ (d). oligos (e).

Para definir o gene controle mais apropriado, foram utilizadas as ferramentas geNorm (VANDESOMPELE et al., 2002) e NormFinder (ANDERSEN et al., 2004).

A ferramenta geNorm se baseia no princípio que a razão da expressão de dois genes controles ideais é idêntica em todas as amostras, independentemente da condição experimental e do tipo celular. A variação na razão de dois genes constitutivos reais reflete o fato de que um (ou ambos) os genes é (são) expressos de forma não constante, com o aumento da variação na razão correspondendo a redução na estabilidade de expressão.

Assim, o geNorm utiliza os dados relativos a expressão gênica obtidos por PCR quantitativo em tempo real (Δct) e calcula de forma pareada a razão de cada gene controle com todos os outros controles, o desvio padrão entre essas razões é transformado logaríticamente e esse é definido como variação pareada padrão, ou medida M. Genes com os menores valores de M (M<1,5) possuem a expressão mais estável.

Partindo de 4 genes candidatos (ubiquitina, GAPDH, YWHAZ e actina) foi feita a primeira análise com o geNorm e a Ubiquitina apresentou o maior valor de M (3,731). Retirando esse gene da análise a ferramenta recalcula os valores de M com os genes restantes e assim por diante. Nessa primeira análise restou o YWHAZ e a actina, porém os dois apresentavam valor de M maior que 1,5 (1,573). O problema com o gene YWHAZ foi a baixa eficiência do oligo durante a reação de qPCR. O experimento de qPCR foi refeito, bem como a análise com o geNorm e novamente não encontrou-se um par de genes que possuíssem valor de M<1,5. A ubiquitina sempre apresentou os maiores valores de M, sendo logo descartada dos experimentos de qPCR. Comparando

125pb Fragmento de

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muito baixos o que indica alta expressão desse gene, como há aumento do tamanho celular da glândula durante o ciclo de produção de veneno (YAMANOUYE et al., 1997) provavelmente ocorre síntese de actina durante o ciclo, o que descarta esse gene como controle para reação de qPCR. Assim, restaram como candidatos os YWHAZ e o GAPDH, devido a baixa eficiência de reação dos oligos do YWHAZ, a melhor solução seria trabalhar apenas com o GAPDH, porém antes as análises foram refeitas utilizando a ferramenta NormFinder.

A ferramenta NormFinder se baseia no uso de um modelo matemático para descrever os valores de expressão medidos pelo qPCR, análises estatísticas separadas para determinar a variação de expressão entre-grupos e intra-grupos e cálculo do “valor de estabilidade” para o gene candidato.

Na prática é necessário fornecer os dados dos Cts, o recomendado pelo grupo que criou essa ferramente é que se utilize pelo menos 8 amostras por grupo e pelo menos 3 genes candidatos, sendo que o ideal é testar de 5 a 10 genes. Como toda ferramenta estatística quanto maior o n avaliado maior a confiança nos resultados obtidos. A ferramenta analisa a variação da expressão dos genes candidatos entre réplicas experimentais (intra-grupos) e entre condições experimentais (entre-grupos) e fornece os valores de estabilidade para cada gene analisado.

Na tabela 13 encontram-se os resultados obtidos na análise do GAPDH, Ubiquitina e actina, o YWHAZ foi descartado dessa análise devido a baixa eficiência de amplificação dos oligos desenhados.

Tabela 13: Determinação de gene candidato a controle da reação de qPCR para

amostras de glândula de veneno extraídas no tempo 0, 1, 2, 4 e 15 dias após a extração manual do veneno. Análise realizada através da ferramenta NormFinder.

Gene name Stability value Best gene GAPDH

GAPDH 0,059 Stability value 0,059

Ubiquitina 0,131

actina 0,112 Best combination of two genes GAPDH and Ubiquitina

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também identificou o GAPDH como o gene mais estável e portanto esse foi o escolhido para ser usado como controle em todas as reações de qPCR realizadas nesse trabalho.