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Quinze espécies identificadas no presente trabalho apresentaram divergência considerável na análise da sequência dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal e representam possíveis espécies novas (Tabela 7). Quatro possíveis espécies novas pertencem ao clado Starmerella. Starmerella sp.1 possui 13 isolados obtidos a partir de amostras de mel e pólen de Scaptotrigona cfr. bipunctata e também de abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a S. etchellsii, com seis pares de bases divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. Starmerella sp.2 possui dois isolados obtidos a partir de amostras de pólen de S. cfr. bipunctata, e é

53 filogeneticamente próxima a S. davenpotii, com 16 pares de bases de divergência nos domínios D1/D2. Starmerella sp. 3 possui três linhagens obtidas a partir de amostras de mel da abelha T. angustula. Essa espécie é filogeneticamente relacionada a S. lactis- condensi, e a divergência em relação à sequência da linhagem tipo é de seis pares de bases. Starmerella sp. 4 possui apenas 1 isolado obtido a partir de amostra de pólen coletado em colmeia de S. cfr. bipunctata, e é filogeneticamente próxima a S. bombicola, com divergência de 4 pares de bases em relação à linhagem tipo.

Duas possíveis novas espécies pertencentes ao clado Zygosaccharomyces foram obtidas a partir de abelhas adultas e substratos associados a Scaptotrigona cfr. bipunctata. Zygosaccharomyces sp. 1 possui 20 isolados obtidos a partir de mel, pólen e abelhas adultas. Essa espécie é filogeneticamente próxima a Z. rouxii (Figura 14), e apresenta 16 pares de bases divergentes em reação à linhagem tipo (CBS:732) na comparação das sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNA ribossomal. Zygosaccharomyces sp. 2 é filogeneticamente próxima a Z. siamensis e possui 3 isolados obtidos a partir de amostras de abelha adulta e mel maduro. Ensaios de esporulação foram realizados e foi possível observar a formação de esporos sexuais pela espécie Zygosaccharomyces sp. 1. (Figura 13). Os esporos observados estão contidos em uma asca permanente, com 2-4 esporos, que apresentam morfologia esferoidal a elipsoidal. Ascas em forma de haltere, típicas do gênero Zygosaccharomyces também foram observadas. A ascosporulação foi observada em meio YM após sete dias de incubação a 25ºC.

Figura 13: Esporos sexuais de Zygosaccharomyces sp.1. Esporo dentro da asca em forma de haltere.

54 Figura 14: Árvore filogenética mostrando o posicionamento da espécie Zygosaccharomyces sp. 1, construída pelo método de ―neighbor-joining‖, baseada em sequências dos domínios D1/D2 do gene do RNAr. Foi utilizado um bootstrap de 1000 interações e a porcentagem é mostrada próxima aos ramos. A distância evolutiva foi calculada pelo método de ―Kimura 2 parâmetros―. A barra de escala mostra a proporção de divergência na sequência. Análise realizada no programa MEGA 7.

Apiotrichum sp.1 foi isolada a partir de abelha adulta e mel imaturo de A. mellifera e é filogeneticamente próxima a A. posorum, com 27 bases divergentes na comparação de sequências dos domínios D1/D2. As outras possíveis espécies novas obtidas possuem apenas um isolado obtido e a designação de possível espécie nova foi baseada na divergência apresentada na comparação de sequencias do domínio D1/D2 do gene do RNA ribossomal. Cyrenella sp. foi isolada de adulto de T. angustula e apresenta 12 pares de bases divergentes em relação a C. elegans. Cystobasidium sp. foi isolado a partir de adulto de S. cfr. bipunctata, com quatro pares de bases diferentes em relação a C. benthicum.

55 Tabela 7: Possíveis novas espécies de leveduras.

Gênero Espécie aproximada/ % identidade/ Acesso GenBank Substrato de isolamento Quantidade

Apiotrichum sp. A. porosum (90%) / (MG707703.1) mel imaturo 1 Cyrenella sp. Cy. elegans (97%) / (KJ708454.1) abelha 1 Cystobasidium sp. Cys. benthicum (99%) /

(KY107427.1) abelha 1 Meyerozyma sp. M. guilliermondii (98%) / (MG707678.1) mel maduro 1 Papiliotrema sp. P. rajasthanensis (98%) / (KY108743.1) abelha 1 Piskurozyma sp. P. taiwanensis (98%) / (KY107271.1) abelha 1 Starmerella sp. 1 S. cf. etchellsii (98% - 99%) / (AY257049.1)

abelha, pólen, mel imaturo, mel maduro

13 Starmerella sp. 2 S. davenportii (95% - 96%) / (EF452219.1) pólen 2 Starmerella sp. 3 S. cf. lactis-condensi (96% - 99%) / (AY257059.1)

mel imaturo, mel maduro 2 Starmerella sp. 4 S. bombicola (99%) / (HQ111045.1) pólen 1 Ustilago sp. 1 U. calamagrostidis (99%) / (AY740119.1) mel imaturo 1 Ustilago sp. 2 U. sporoboli-indici (99%) / (MF716450.1) mel maduro 1 Vishniacozyma sp. V. victoriae (92%) / (MG735809.1) mel imaturo 1

Zygosaccharomyces sp.1 Z. mellis (97%) / (KY110273.1) abelha, mel imaturo, mel maduro, pólen

23 Zygosaccharomyces sp.2 Z. siamensis (99%) /

(KY110251.1)

abelha, mel maduro 3

Total 53

Meyerozyma sp. foi isolada de mel maduro de A. melifera e apresenta seis pares de bases divergentes em relação a M. gulliermondii. Papiliotrema sp. foi obtida a partir de adulto de A. mellifera e apresenta quatro pares de base divergentes em relação a P. rajasthanensis. Piskurozyma sp. foi isolada de adulto de S. cfr. bipunctata e apresenta uma divergência de oito pares de bases em relação a P. taiwanensis. Ustilago sp. 1 foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 14 pares de bases divergentes em

56 relação a U. calamagrostidis. Já Ustilago sp. 2 foi obtida a partir de mel maduro de S. cfr. bipunctata e apresenta 32 pares de bases divergentes em relação a U. sporoboli- indici. Vishiniacozyma sp. foi isolada de mel imaturo de T. angustula e apresenta 30 pares de bases divergentes em relação à sequência de V. victoriae. Futuramente serão realizadas novas análises de sequenciamento utilizando os primers ITS1/ITS4 para confirmação das novas espécies e posterior descrição.

57 7 CONCLUSÃO

 As comunidades de leveduras estudadas apresentaram baixo compartilhamento de espécies e elevado número de espécies exclusivas o que indica que possivelmente as abelhas possuem segregação de locais de forrageio, que pode resultar em uma menor competição por alimentos.

O elevado número de espécies de leveduras do gênero Starmerella, aliado ao grande compartilhamento de espécies desse gênero entre as espécies de abelhas, indica forte endemismo de espécies de Starmerella a abelhas e substratos a estas relacionados.

 A similaridade apresentada entre as três comunidades de leveduras estudadas apresentou baixos valores. Além disso, a curva de acumulação de espécies não apresentou estabilidade para nenhuma das três comunidades. Esses dados indicam que um maior esforço amostral é necessário para cobrir a riqueza de leveduras das comunidades estudadas.

 O isolamento de 15 possíveis espécies novas no presente trabalho mostra o potencial dos substratos estudados para o isolamento de espécies ainda não descritas, além de evidenciar a importância de estudos de biodiversidade de leveduras associadas a abelhas.

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