Espectrometria de massa

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Figura II -25 – Representação esquemática da fonte iónica do tipo MALDI (A) e dois tipos de analisadores de massa: (B) TOF e (C) FT-ICR. (adaptado de Schuchardt, et al., 2007)

Os métodos de análise de proteínas mais comuns consistem num passo de separação destas por electroforese, seguido da conversão das proteínas em péptidos para a obtenção da sua massa específica e identificação da proteína com a sequência correspondente.

O método mais utilizado é o de peptide mass fingerprinting (PMF) (Figura II -26) por ser mais rápido. Este baseia-se na digestão das proteínas com um protease de especificidade elevada para determinados resíduos, como a tripsina (que cliva nos resíduos de lisina e arginina, excepto quando estes estão adjacentes a uma prolina) e no facto dos péptidos produzidos a partir de determinada proteína serem únicos. Isto significa que o conjunto de massas obtidas a partir da análise dos péptidos pode ser comparado com um conjunto de massas calculadas em bases de dados, para a identificação da proteína (Schuchardt, et al., 2007).

Figura II -26 – Esquema do processo de análise proteica pelo método de PMF. 1. Obtenção dos espectros por

espectrometria de massa correspondentes aos péptidos obtidos na digestão, 2. Obtenção de uma lista de picos dos péptidos detectados que depois é comparada a uma base de dados como a Mascot e identificar as proteínas.

(adaptado de Schuchardt, et al., 2007)

6.1. Digestão in gel das proteínas

De forma a minimizar contaminações das amostras com outras proteínas, foi necessário tomar algumas precauções, como o uso obrigatório de luvas, bata e material estéril.

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6.1.1. Excisão

Para a análise por PMF as proteínas foram primeiro digeridas segundo um protocolo que é iniciado pela excisão das bandas ou spots pretendidos a partir dos géis. No caso de serem bandas, estas tiveram que ser cortadas em “cubos” de aproximadamente 1 mm3.

6.1.2. Lavagem

De seguida, as bandas ou spots foram lavados. No caso de terem sido corados com azul de coomassie, começou-se por incubá-las em água milliQ durante 20 minutos, a 37 °C e depois em 50% acetonitrilo (ACN) (Merck), durante 30 minutos, a 37 °C, repetindo-se este passo até as bandas estarem transparentes. Por último, as bandas ou spots foram “comprimidas ou desidratadas” com 100% de ACN, por 30 minutos, a 37 °C. No caso de as bandas ou spots terem sido corados com prata, aos passos descritos anteriormente antecedeu-se o passo da incubação com potassium ferricyanide/sodium thiosulfate 1:1, no escuro. Todas as incubações foram realizadas com agitação.

6.1.3. Redução e alquilação

A redução e alquilação das bandas de gel facilita a acção do protease e apenas são efectuadas para os géis unidimensionais, pois o procedimento dos géis bidimensionais já contém um passo de redução e alquilação das proteínas.

Em primeiro lugar, as proteínas foram reduzidas incubando-se as bandas com 10 mM de DTT (Sigma) em 100 mM de NH4HCO3 (Sigma), durante 45 minutos a 56 °C. De seguida as proteínas foram alquiladas, incubando-se as bandas com 55 mM de iodoacetamida (Sigma) em 100 mM de NH4HCO3, durante 30 minutos, no escuro.

Depois de reduzidas e alquiladas as bandas foram lavadas com 50% de ACN duas vezes durante 10 minutos para remover o excesso de DDT e iodoacetamida e “comprimidas” de novo, com 100% de ACN. Todas as incubações foram realizadas com agitação de forma a aumentar a eficácia de cada passo em questão.

No final, as bandas foram secas numa centrífuga de vácuo (Speed Vac Concentrator – Savant).

6.1.4. Digestão com tripsina

Neste passo as bandas ou spots foram re-hidratados com tampão de digestão composto por 50 mM de NH4HCO3 e 6.7 ng/µl de tripsina (Promega), durante 30 minutos. Este passo foi efectuado a 4°C de modo a impedir a auto-protólise do enzima. De seguida, as bandas ou spots foram incubadas em NH4HCO3, a 37 °C, durante a noite, para promover a digestão proteica.

No final do procedimento as bandas e a solução de péptidos foram separadas dos pedaços de gel e armazenadas a -20 °C.

6. Espectrometria de massa

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6.2. Purificação e aplicação na placa dos péptidos digeridos

Antes da sua colocação na matriz, a mistura de péptidos obtida deve ser purificada e concentrada de forma a remover todos os sais e outros contaminantes que possam estar presentes na amostra. Para isso recorreu-se a uma micro-coluna de cromatografia de fase reversa do tipo C8 (Poros reverse phase R2 - Applied Biosystems).

6.2.1. Preparação da coluna

O protocolo de preparação da coluna passou pela activação da resina com ACN 50 % e equilíbrio da mesma com ácido trifluoroacético (TFA) (Sigma) 0,1 %, solução na qual a resina é conservada.

6.2.2. Purificação e concentração dos péptidos

O protocolo de purificação compreende a eluição do TFA, seguida da aplicação e eluição da amostra e nova lavagem com TFA 0,1%. De seguida é aplicada a solução de matriz (10 g/L de CHCA18 (Sigma) em 50% ACN com 0,1% TFA) e os péptidos são eluídos directamente para a placa de MALDI AnchorChip (Bruker Daltonics, Bremen).

6.3. Obtenção dos espectros e das massas

A mistura de péptidos foi analisada através de MALDI-FT-ICR-MS num espectrómetro de massa Bruker Apex Ultra, Apollo II combi-source (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha), com um íman de 7 Tesla (Magnex corporation, Oxford UK) e em colaboração com o ITQB num MALDI-TOF-TOF (Apllied Biosystems) com a colaboração com Dr. Ricardo Gomes.

As massas dos picos monoisotópicos dos péptidos foram determinadas pelo programa Data

Analysis versão 3.4, através do algoritmo SNAP 2 (Bruker Daltonics). Estas foram depois

submetidas ao programa de identificação de proteínas Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido; http://www.matrixscience.com) e analisadas com o programa Biotools 3.1 (Bruker Daltonics).

6.4. Identificação das proteínas por PMF

Para a comparação das massas dos péptidos e identificação das proteínas correspondentes utilizaram-se bases de dados como MSDB (base de dados de sequências proteicas não idênticas, do Departamento de Proteómica do Campus Hammersmith, Imperial College, Londres; http://csc-fserve.hh.med.ic.ac.uk/msdb.html) e UniProtKB/SwissProt (base de dados de sequências não-redundantes de proteínas, Expasy; http://www.uniprot.org). Foi considerada um erro máximo de 10 ppm.