Espectrometria de massas

Cromatografia a líquido acoplada a uma fonte de ionização à pressão atmosférica em espectrometria de massas sequencial (MS/MS) é atualmente considerada como um método de escolha para análises quantitativas de compostos em matrizes biológicas. As vantagens em utilizar MS/MS no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM) são, principalmente, aumento da seletividade e sensibilidade (MATUSZEWSKI, CONSTANZER e CHAVEZ-ENG, 2003; TAYLOR, 2005; XU et al., 2007). A seletividade inerente aos métodos por cromatografia a líquido acoplada a MS/MS resultam em cromatogramas que não apresentam interferentes aparentes, embora concentrações relativamente altas dos componentes da matriz estejam presentes (HERNÁNDEZ, SANCHO e POZO, 2005).

Espectrometria de massas (MS) é uma técnica analítica para separação de moléculas ionizadas pela diferença do movimento dos íons com base em sua massa. Os íons formados na fonte de ionização são acelerados pela energia acrescentada e transportados para o analisador de massa. Eles são separados pela movimentação característica de acordo com a razão massa/carga (m/z) (MANO e GOTO, 2003).

O uso da detecção por espectrometria de massas no modo de monitoramento do íon único (SIM) ou MRM utilizando instrumentos do tipo triplo-quadrupolo praticamente substituíram a detecção por ultravioleta (UV) para bioanálises. A detecção por MS oferece muitas vantagens sobre a detecção por ultravioleta e tem permitido resolver muitos dos problemas analíticos tais como sensibilidade, seletividade e velocidade de recuperação das condições iniciais (WILSON, 2003).

1.1.1 Espectrometria de massas com ionização por electrospray

Espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) tem se difundido nas mais diversas áreas da ciência, seja para simples determinação da massa molar e/ou quantificação de uma substância ou mesmo em estudos de

determinação estrutural (CROTTI, 2006). ESI-MS tornou-se popular como um detector de analitos por sua especificidade, sensibilidade e capacidade de gerar informações estruturais (HENRIKSEN e JUHLER, 2005), bem como uma alternativa para geração de íons a partir de espécies pouco voláteis presentes em fase líquida (MORAES e LAGO, 2003). Essa é uma das técnicas analíticas mais empregadas, devido à sua ampla aplicabilidade para detectar pequenas (por exemplo, metabólitos) e grandes (por exemplo, proteínas) moléculas, bem como o possível acoplamento com cromatografia a líquido (CROTTI, SERAGLIA e TRALDI, 2011). ESI-MS envolve a formação de um spray eletrostático, a partir do qual são geradas pequenas gotas carregadas e dessas são liberados os íons (MORAES e LAGO, 2003). Uma solução diluída do analito é bombeada através de um capilar a um baixo fluxo (0,1-10 µL/min) e uma alta voltagem (2-5 kV) aplicada ao capilar, podendo ser negativa ou positiva, dependendo do analito de escolha. A voltagem aplicada provê o campo elétrico necessário para a separação da carga produzida na superfície do líquido. Como resultado, o líquido é liberado na extremidade do capilar formando o conhecido “Cone de Taylor” (CECH e ENKE, 2001). A eficiência de ionização é baseada na relação entre as propriedades dos grupos iônicos na molécula alvo e o valor de pKa dos componentes ácidos dos sais adicionados à fase móvel (IKEGAWA

et al., 1997).

A aplicação de um alto campo elétrico na ponta do capilar metálico do electrospray leva à separação parcial dos íons positivos em relação aos eletrólitos negativos em solução, isso porque o campo penetra parcialmente a superfície do líquido na extremidade do capilar. No modo íon positivo, por exemplo, a densidade dos íons positivos aumenta na superfície do líquido na ponta do capilar em forma de gota, enquanto que os íons negativos orientam-se em direção às laterais. A repulsão dos íons positivos na superfície e a força do campo elétrico sobre os mesmos vencem a tensão superficial do líquido e expande-se formando o “Cone de Taylor”, cuja ponta se alonga em um filamento de líquido. Esse filamento rompe-se em partículas individuais carregadas (KEBARLE, 2000), conforme representado na Figura 23.

Figura 23 - Ilustração do procedimento de ionização por electrospray no modo positivo.

Fonte: adaptado de BLADES, IKONOMOU e KEBARLE, 1991.

A formação dos íons na fase gasosa pode ser explicada por dois mecanismos denominados de modelo de carga residual (charged residue model, CRM) e modelo da evaporação do íon (ion evaporation model, IEM). No primeiro modelo, considera- se que ocorre aumento da densidade de carga devido à evaporação do solvente resultando na divisão da gota em pequenas gotículas, que eventualmente consistem em um único íon (explosão de Coulomb). O segundo modelo sugere que o aumento da densidade de carga devido à evaporação do solvente, ocasiona repulsão entre as cargas aumentando a tensão superficial do líquido, o que resulta na liberação dos íons da superfície da gota (MORAES e LAGO, 2003; CECH e ENKE, 2001). A

Figura 24 ilustra os dois modelos de formação dos íons na fase gasosa.

Após a formação dos íons, eles alcançam uma região de baixa pressão, onde há um conjunto de lentes que os conduzem ao analisador de massas. Nessa região, podem ocorrer dissociações induzida por colisão (CID), em que ocorre a colisão entre os íons e as moléculas do gás secante (nitrogênio) (MORAES e LAGO, 2003).

Figura 24 - Descrição esquemática do modelo de carga residual (CRM) e do modelo de evaporação do íon (IEM).

Fonte: adaptado de CROTTI, SERAGLIA e TRALDI, 2011.

Como o método por ESI-MS é muito sensível, concentrações baixas do analito podem ser usadas mantendo a linearidade na faixa de concentração de 10-7 a 10-3 mol/L (KEBARLE e VERKERK, 2009). Consideráveis variações na resposta da ionização por electrospray é observada para pequenas moléculas polares e muito tempo é frequentemente requerido para otimizar as condições analíticas específicas para um analito particular (HENRIKSEN e JUHLER, 2005).

1.1.2 Analisador de massas do tipo triplo-quadrupolo

Um analisador de massas do tipo triplo-quadrupolo realiza análises MS/MS com a dissociação induzida por colisão. No primeiro quadrupolo, o íon precursor é selecionado e o segundo quadrupolo funciona como um espaço para a fragmentação com CID. Os íons fragmentados são separados pela razão m/z no terceiro quadrupolo (MANO e GOTO, 2003). Triplo-quadrupolo tem a vantagem de permitir experimentos utilizando espectrometria de massas sequencial, mas são limitados a uma faixa máxima de aproximadamente 4000 m/z (HILTON e BENESCH, 2012). O espectro MS/MS é capaz de discriminar entre a molécula alvo e impurezas, que são eluídas simultaneamente, e pode identificar facilmente o composto de interesse (MANO e GOTO, 2003). LC/MS/MS em comparação com CLAE-UV requer um menor preparo da amostra por ser uma técnica altamente seletiva e, por isso, a separação cromatográfica dos analitos não é necessária (ANNESLEY, 2003).