Espectros Micro-Raman e atribuição dos modos vibracionais

Para este estudo, o nível de significância (ou erro estatístico) admitido foi de 5 %, valor que indica o quanto foi admitido errar nas conclusões estatísticas. Desta forma, se mostra apropriado lembrar que todos os intervalos de confiança do trabalho foram construídos com 95 % de confiança estatística.

Foram utilizados testes e técnicas estatísticas não-paramétricas, pois como já mencionado previamente, as condições (suposições) para a utilização de técnicas e testes paramétricos, como a normalidade (teste de Anderson-Darling) e homocedasticidade ou homogeneidade das variâncias (teste de Levene), não foram encontradas (principalmente a normalidade) no conjunto de dados. Os resultados do teste de Normalidade podem ser observados nos Anexos 3, 4, 5 e 6 para o grupo Pele Normal pré-processado manualmente, para o grupo Melanoma pré-processado manualmente, para o grupo Pele Normal pré-processado automaticamente e para o grupo Melanoma pré-processado automaticamente, respectivamente.

Como resultado do Teste para o Coeficiente de Correlação de Spearman, foram verificados que todos os espectros foram bem correlacionados. As tabelas de correlação relacionaram cada espectro a todos os outros gerando uma tabela de grandes dimensões (28224 dados para cada pré-processamento do grupo Pele Normal e 22500 dados para cada pré-processamento do grupo Melanoma Cutâneo), sendo que por essa razão, propositalmente, não foram incluídas na tese.

Estabelecido que há boa correlação entre os espectros do grupo Pele Normal e Melanoma Cutâneo, para a primeira observação dos espectros adquiridos foram desenhados gráficos de Box Plot para o grupo Pele Normal e para o grupo

Melanoma Cutâneo, pré-processados manualmente e automaticamente, que podem ser observadas, respectivamente, nas Figuras 9 e 10.

1770,03 1715,82 1660,96 1605,57 1549,60 1493,04 1435,86 1378,10 1319,72 1260,68 1201,01 Deslocamento Raman (cm-1) In te n si d ad e R am an ( u .a .) 1770,06 1715,80 1660,93 1605,57 1549,60 1493,05 1435,86 1378,06 1319,70 1260,64 1201,08 2,4 1,6 0,8 0,0 -0,8 -1,6 Deslocamento Raman (cm-1) In te n si d ad e R am an ( u .a .) PELE NORMAL MELANOMA CUTÂNEO

Figura 9. (a) Gráfico Box Plot com a distribuição dos 168 espectros adquiridos na epiderme da Pele

Normal pré-processada manualmente. A linha preta representa a mediana e a sombra em lilás representa os dados entre o primeiro e o terceiro quartis. (b) Gráfico Box Plot com a distribuição dos 150 espectros adquiridos do Melanoma Cutâneo pré-processados manualmente. A linha preta representa a mediana e a sombra em salmão representa os dados entre o primeiro e o terceiro quartis.

Na Figura 9 observam-se os gráficos Box Plot, no deslocamento Raman entre 1200 a 1800 cm-1 _{para: (a) distribuição dos 168 espectros adquiridos na epiderme}

da Pele Normal e (b) distribuição dos 150 espectros adquiridos na epiderme da parte nodular do Melanoma Cutâneo pré-processados manualmente. As linhas pretas representam a mediana e as sombras coloridas (lilás e salmão) representam inferiormente à mediana 25 % dos espectros e superiormente à mediana 75 % dos espectros.

Figura 10. (a) Gráfico Box Plot com a distribuição dos 168 espectros adquiridos na epiderme da

Pele Normal. A linha preta representa a mediana e a sombra em salmão representa 75 % (terceiro quartil) dos espectros mais correlacionados. (b) Gráfico Box Plot com a distribuição dos 150 espectros adquiridos da parte nodular do Melanoma Cutâneo. A linha preta representa a mediana e a sombra em azul representa 75% (terceiro quartil) dos espectros mais correlacionados.

Na Figura 10 observam-se os gráficos Box Plot, no deslocamento Raman entre 1200 a 1800 cm-1 para: (a) distribuição dos 168 espectros adquiridos na epiderme da Pele Normal e (b) distribuição dos 150 espectros adquiridos na epiderme da parte nodular do Melanoma Cutâneo pré-processados automaticamente. As linhas pretas representam a mediana e as sombras coloridas (lilás e salmão) representam inferiormente à mediana 25 % dos espectros e superiormente à mediana 75 % dos espectros.

As variações espectrais encontradas nas Figuras 9 e 10 puderam ser inferidas para as seguintes bandas (ou modos vibracionais): a região entre 1290 e 1490 cm-1_{, onde ainda se destacou o pico em 1440 cm}-1 _{e as bandas centradas em}

1260 cm-1_{, 1550 cm}-1_{, 1650 cm}-1 _{e 1770 cm}-1_{. Esses modos vibracionais podem ser}

atribuídos ao conteúdo bioquímico presente na epiderme e derme, sendo, principalmente colágeno, elastina, queratina e lipídios. As regiões espectrais entre 1200 a 1300 cm-1 _{(Triptofano, Fenilalanina e Amida III em proteínas) e 1440 cm}−1 _(vibração

estratos da pele. Estas diferenças se mostraram mais marcantes entre a Pele Normal e o Melanoma Cutâneo. Para o Melanoma cutâneo, na região de 1260 cm-1, a mediana não se mostrou muito evidente, entretanto, houve muita variação entre os espectros, identificando que essa região, que bioquimicamente infere a presença de Triptofano, Fenilalanina e Amida III em proteínas, está alterada em algumas estruturas encontradas nos tecidos de melanoma deste estudo: tecido inflamatório, colágeno e queratina. A banda em 1440 cm−1, referente à vibração CH2 em proteínas e lipídios,

apresentou diferenças de intensidade marcantes, possivelmente em relação aos diferentes tipos celulares descritos para o Melanoma Cutâneo (Nodular), como por exemplo tecido inflamatório, colágeno, queratina, tecido adiposo e tecido necrótico. O pico em 1650 cm−1 referente à proteínas (Amida I) e lipídios, assim como o pico em 1550 cm−1 (Triptofano) se apresentaram menos intensos no tecido de Pele Normal em relação ao Melanoma Cutâneo. Essas diferenças são evidentes variações espectrais em função da profundidade (dos estratos da pele) e do estado patológico (Melanoma).

E importante ressaltar que a região entre 1290 e 1490 cm-1 (com centro em 1380 cm-1) e a banda em 1550 cm-1 identificam a presença de melanina. Essas características espectrais refletem as bandas D, D’, G, G’ encontradas no espectro da melanina isolada, centradas em 1347, 1407, 1554 e 1608 cm-1_{, respectivamente. Esses}

modos vibracionais podem ser atribuídos ao estiramento do anel aromático da ligação C=C. Mudanças na freqüência e largura destas bandas (D e G) podem ocorrer devido ao ambiente biológico quando a melanina é observada nos tecidos, tanto in vitro (em tecidos) quanto in vivo. Mostra-se interessante mostrar neste momento um espectro característico da melanina isolada coletada in vitro, para facilitar a compreensão da grande diferença inferida aos espectros seguintes pela aplicação do método de pré- processamento automático (subtração de um polinômio de 5º Grau).