As análises de espectroscopia da região do infravermelho por transformada de Fourier foram realizadas para avaliar possíveis interações entre proteínas da peçonha e as nanopartículas de quitosana (Figura 8). No espectro obtido para as nanopartículas, os grupamentos N-H e C=O correspondentes a amida da quitosana são registrados em 1560 cm-1 e 1653 cm-1, respectivamente (ROCHA SOARES et al., 2012; ANTONIOU et al.,
2015). Os grupamentos P=O e P-O-P correspondentes ao agente gelificante TPP ocorreram em 1215 cm-1 e 910 cm-1, respectivamente (ROCHA SOARES et al., 2012,
2017; ANTONIOU et al., 2015). No espectro da peçonha de C. d. cascavella, a banda característica C=O dos grupos carboxila de amida secundária de proteínas foi registrada em 1649 cm-1. Essa banda fornece informações importantes sobre a forma α-helicoidal de polipeptídeos na estrutura secundária das proteínas (ARÊAS et al., 1989). Além disso, a maior intensidade destas bandas no espectro de nanopartículas de quitosana contendo peçonha a 0,5%, devido as novas interações da amida, ocasionadas pelo processo de obtenção das nanopartículas por gelificação iônica, corroborou com os resultados da adsorção e incorporação de proteínas nas nanopartículas, como demonstrado nos experimentos de eficiência de incorporação das proteínas.
Figura 8 - Espectros na região do infravermelho da peçonha bruta (CDC), nanopartículas de quitosana
(NPQ) e nanopartículas contendo a peçonhas por adsorção (NPQ-CDC-Ads0,5%) e (B) incorporação (NPQ-CDC-Inc-0,5%).
Fonte: Autoria própria
Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo de pesquisa estabeleceram a estequiometria entre a quitosana e o agente de gelificação TPP para obter nanopartículas
de quitosana estáveis e estreitas capazes de incorporar proteínas (ROCHA SOARES et al., 2017). As interações dos grupos amino catiônicos da quitosana com os grupos P=O e O-P-O aniônicos de TPP, resultantes da reticulação eletrostáticas da quitosana-TPP, foram avaliadas usando espectroscopia FT-IR (ROCHA SOARES et al., 2012, 2017). Os dados experimentais da figura 6 corroboram com estudos de Rocha Soares (2012, 2017, 2018), no entanto, quando a peçonha de Bothrops jararaca, B. erythromelas e Tityus
serrulatus foram incorporadas nas NPQ, as proteínas foram adicionadas apenas na
solução de TPP antes da reticulação e formação de nanopartículas (método de incorporação). Foi possível observar perturbações nas interações quitosana-TPP, que foram identificadas principalmente na faixa de 890 a 1200 cm-1, devido à competição de proteínas aniônicas das diferentes peçonhas utilizadas com TPP por grupos amino catiônicos de quitosana, induzindo reticulação proteína-quitosana e aumentando a TPP livre nas partículas (ROCHA SOARES et al., 2017,2018). Neste estudo foi utilizado além do método de incorporação, mais um mecanismo para a ligação de proteína diferente, a adsorção peçonha de CDC em NPQ, que induziu um ligeiro aumento de bandas nesta região, com um desvio de 910 para 919 cm-¹, sugerindo que esta competição também pode ocorrer quando as proteínas são adsorvidas (ROCHA SOARES et al., 2018). Da mesma forma foi observado para as nanopartículas com a peçonha de CDC incorporada, com um desvio de 910 para 930 cm-1. Esse resultado é importante e deve ser seguido para
explicar possíveis diferenças na eficiência de incorporação, estabilidade de proteína e taxa de liberação de proteína das nanopartículas (MESQUITA et al., 2017). Geralmente, interações hidrofóbicas podem ocorrer entre cadeias alifáticas do copolímero com os grupos hidrofóbicos das proteínas (aminoácidos hidrofóbicos). No entanto, o caráter hidrofílico e catiônico da quitosana parece desempenhar um papel importante. A maior intensidade de bandas atribuídas aos grupos amida N−H (1653 cm-1) e C−N (1560 cm-1) foi observada devido à interação da proteína com o copolímero, quando comparada com a dos espectros de NPQ. Este fato não sugere redução do conteúdo de alfa-hélice das proteínas e uma exposição distinta após sua adsorção e incorporação nas nanopartículas de quitosana (MANDEVILLE; TAJMIR-RIAHI, 2010; BEKALE; AGUDELO; TAJMIR-RIAHI, 2015)
Além disso, estudos de espectroscopia de FT-IR (Figura 6) corroboraram que as concentrações de veneno testadas (0,5%) foram eficientemente adsorvidas e incorporadas nas NPQ. Esse resultado foi confirmado devido às interações intermoleculares observadas dos grupos carboxila das proteínas da peçonha com os grupos amina de quitosana. Os
espectros das NPQ associadas com a peçonha de CDC (método de adsorção e incorporação) exibiram maior intensidade de estiramento a 1560 e 1653 cm-1 do que o
das NPQ, causado pela adsorção e incorporação de proteínas. A adsorção e incorporação de proteínas no material polimérico pode ocorrer principalmente por interações hidrofóbicas ou eletrostáticas (GAN; WANG, 2007; MESQUITA et al., 2017).
5.4 Microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo
A forma e a superfície das nanopartículas de quitosana com e sem associação da peçonha de C. d. cascavella nas diferentes concentrações testadas (0,5 e 1,0%), por ambos métodos de obtenção foram analisadas por imagens de Microscopia de força atômica (MFA) e Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEVFEG). As imagens obtidas por ambas as técnicas demonstraram partículas levemente esféricas, com superfície ligeiramente lisa (Figura 9). Comparando as imagens 2D e 3D de MFA e MEVFEG das nanopartículas sem associação da peçonha (A) com as nanopartículas carregadas com a peçonha (Figura 9B, 9C, 9D e 9E) certifica-se que a carga da proteínas não interferiu na formação das nanopartículas esféricas e lisas (DOS SANTOS-SILVA et al., 2017). Entretanto houve um leve aumento de tamanho em - comparação aos valores obtidos pela técnica de DLS, o qual pode ocorrer devido aos diferentes fundamentos dos métodos usados e o modo de preparo das amostras para cada análise. Para ambas as análises de microscopia, as amostras são submetidas a um período de secagem (24 horas), o que pode levar as nanopartículas a formarem agregados e terem seu tamanho aumentado, ou terem sua camada de hidratação superficial retirada, reduzindo o tamanho da nanopartícula (HOO et al., 2008; MESQUITA et al., 2017).
Figura 9 - Imagens de microscopia de força atômica em 2D (segunda dimensão), 3D (terceira dimensão) e
microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo de nanopartículas de quitosana contendo a peçonha de Crotalus durissus cascavella, respectivamente. (A) nanopartículas de quitosana, nanopartículas de quitosana contendo a peçonha obtidas pelo método de adsorção na concentração de (B) 0,5 e (C) 1,0%, nanopartículas de quitosana contendo a peçonha obtidas pelo método de incorporação na concentração de (D) 0,5 e (E) 1,0 %.
A uniformidade do tamanho de partícula além de implicar na estabilidade da formulação, também é muito importante para a escolha da via de administração do nanossistema. As vias intravenosa e intramuscular são muito comuns para a administração de proteínas com atividade farmacológica, sendo bem estabelecido que o tamanho de partícula/gotícula de formas farmacêuticas destinadas a corrente sanguínea ou a circulação linfática deve variar em torno de 100 - 200 nm (SHEKUNOV et al., 2007). Estudos demonstraram que nanopartículas de quitosana contendo um β- lactoglobulina apresentaram formas esféricas quando analisada por microscopia eletrônica de varredura (CARO-LEÓN et al., 2018). Também foi possível observar por FEGMEV no estudo de Gholami et al (2018) que as estruturas das nanopartículas de quitosana obtidas pela técnica de gelificação iônica eram esféricas com uma distribuição de tamanho uniforme, juntamente com superfícies lisas (GHOLAMI et al., 2018). Kumar e colaboradores (2016) também observaram na MFA imagens esféricas típicas ou forma elipsoidal de nanopartículas de quitosana incorporadas com RNA de interferência no intuito de empregar no controle de pragas (RAMESH KUMAR et al., 2016).
5.5 Estudo de estabilidade
O estudo de estabilidade das nanopartículas foi realizado para observar possíveis instabilidades físicas dos sistemas. A estabilidade física das nanopartículas de quitosana associadas ou não a peçonha de C. d. cascavella, nas diferentes concentrações (0,5 e 1,0%) e obtidas por ambos os métodos (adsorção e incorporação) foi avaliada por oito semanas, através de análises do diâmetro das partículas e do índice de polidispersidade uma vez por semana. As amostras foram armazenadas a 4 ± 2 °C, mas a análise foi realizada com as amostras na temperatura ambiente (25 °C).
Os resultados demonstraram um desempenho incrível para as nanopartículas brancas e carregadas de proteína pelo método de adsorção (Figura 10) e incorporação (Figura 11) em ambas as concentrações (0,5 e 1,0%). Comparando as análises da 1ª a 8ª semana, observamos que as alterações no tamanho das nanopartículas foram mínimas, variando em torno de ± 20 nm. Com relação ao índice de polidispersidade as nanopartículas brancas e as nanopartículas com a peçonha incorporada e adsorvida apresentaram entre 0,3 e 0,4, com pequenas variações. Os mesmos parâmetros foram avaliados durante 4 meses, tanto para método de adsorção (Figura 12) como incorporação
(Figura 13). Não houve diferença estatística entre as formulações, indicando uma homogeneidade do tamanho das partículas dos sistemas.
Figura 10 - Estudo de estabilidade físico-química de nanopartículas partículas de quitosana (NPQ);
nanopartículas partículas de quitosana contendo a peçonha da Crotalus durissus cascavella pelo método de adsorção (NPQ-CDC-Ads) na concentração de 0,5 e 1,0 % no período de 8 semanas.
Fonte: Autoria própria
Figura 11 - Estudo de estabilidade físico-química de nanopartículas partículas de quitosana (NPQ);
nanopartículas partículas de quitosana contendo a peçonha da Crotalus durissus cascavella pelo método de incorporação (NPQ-CDC-Inc) na concentração de 0,5 e 1,0 % no período de 8 semanas.
Figura 12 - Estudo de estabilidade físico-química de nanopartículas partículas de quitosana (NPQ);
nanopartículas partículas de quitosana contendo a peçonha da Crotalus durissus cascavella pelo método de adsorção (NPQ-CDC-Ads) na concentração de 0,5 e 1,0 % no período de 4 meses.
Fonte: Autoria própria
Figura 13 - Estudo de estabilidade físico-química de nanopartículas partículas de quitosana (NPQ);
nanopartículas partículas de quitosana contendo a peçonha da Crotalus durissus cascavella pelo método de incorporação (NPQ-CDC-Inc) na concentração de 0,5 e 1,0 % no período de 4 meses.
É fundamental para aplicação terapêutica das nanopartículas a manutenção da estabilidade, uma vez que suspensões coloidais estão sujeitas a instabilidades com o tempo, podendo apresentar fenômenos de floculação, cremagem, sedimentação e coalescência (SHEKUNOV et al., 2007). Nenhuma das formulações analisadas apresentaram fenômenos de instabilidade.