Espectroscopia de Emissão de Fluorescência

As medidas de emissão de fluorescência da ThCBHI foram realizadas utilizando-se o espectrofluorímetro K2 (ISS Inc. Champaign, IL, EUA). Os espectros de fluorescência foram obtidos a temperatura controlada de 25°C. Amostras foram excitadas a 295nm e a emissão da fluorescência foi monitorada no intervalo de 300 a 450 nm. Cubetas de quartzo de 1cm de caminho ótico foram utilizadas nas medidas. A fim de minimizar o efeito do espalhamento de luz, os espectros de emissão de fluorescência dos tampões foram subtraídos dos espectros da amostra. Foram analisadas as possíveis mudanças conformacionais da ThCBHI induzidas por influência do pH nas mesmas condições das medidas de CD.

3.20 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)

A metodologia de espalhamento de luz dinâmico permite a determinação da massa molecular e o raio de giro de macromoléculas em solução a partir das flutuações de luz espalhada pelas amostras. O espalhamento de raios X a baixo ângulo é um processo de espalhamento elástico que ocorre quando o feixe de raios X atravessa a amostra e interage com os elétrons do material. As frequências das flutuações dependem do quão rapidamente as moléculas estão se movendo por difusão, essa técnica permite relacionar esse fato com o tamanho da molécula estudada. Essa técnica foi empregada para avaliarmos o estado de oligomerização em solução da proteína ThCBHI. 98

Para este ensaio foi utilizado 0,5 mg /mL de ThCBHI a pH 5,0 foi centrifugado a 4,000x g durante 15 min à temperatura ambiente e imediatamente antes da medições colocada em uma cubeta de quartzo (caminho ótico de 1 cm). As medidas de DLS foram realizadas utilizando o instrumento Zetasizer (Malvern Instrument, Worcestershire, Reino Unido) no Laboratório de Biofísica Molecular (IFSC-USP). A temperatura foi elevada de 25-80º C com 5 ºC intervalos a cada 120 s para o equilíbrio das temperaturas. O efeito do tampão foi subtraído de cada medida para eliminar o ruído produzido por ele. O raio hidrodinâmico foi calculado usando a Zetasizer Software lV.

3.21 Estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS)

Os estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo são utilizados para análises estruturais de baixa resolução de macromoléculas em solução e nos dão informações sobre o estado de oligomerização da proteína e dados complementares às obtidas pela cristalografia de proteínas. As medidas de SAXS foram realizadas na linha SAXS 2 no Laboratório Nacional de Luz Síncrontron (LNLS), em Campinas-SP, em colaboração com o Dr. Mario de Oliveira Neto do Instituto de Física da USP/São Carlos.

A primeira parte dos estudos de SAXS com a ThCBHI, foram realizados pela Dra. Viviane Serpa, onde foi definido o tamanho da proteína, a massa molecular, e um modelo tridimensional, gerado por modelagem ab initio.

Em uma segunda parte foram realizados estudos de estabilidade para observar o efeito de pH e temperatura na estrutura e na compactação da ThCBHI.

Os dados de (SAXS) para a ThCBHI, _{utilizando comprimento de onda =1.48 Å,} detector bidimensional (MarCCD) e distância amostra-detector de 1026.96 mm, cobrindo um intervalo de transferência de momento de 0.015 Å-1 < q < 0.33 Å-1. As curvas de espalhamento da solução da ThCBHI e do tampão foram coletadas em 1 etapa de 300 segundos para monitoramento dos danos causados pela radiação à amostra, além da estabilidade do feixe. Análise sistemática foi realizada subtraindo os dados pelo ruído gerado pelo CCD no mesmo tempo de exposição, em seguida, normalizando-os pela intensidade do feixe incidente e multiplicando-os pela absorção da amostra. O espalhamento da solução tampão foi subtraído da curva de espalhamento da solução de proteína nas diferentes concentrações.

A integração dos padrões bidimensionais de SAXS foi realizada usando software Fit2D

99_{, e as curvas foram escalonadas pela concentração de proteína. A concentração de ThCBHI}

para este experimento de rampa térmica foi 0,5 mg/mL. Amostras de ThCBHI foram incubadas em pH variando de 2 a 10 e os tampões utilizados foram 20 mM de fosfato / ácido cítrico ou Gly / NaOH ajustados para os valores de pH diferentes. As incubações foram por 12h a 25 ºC. A desnaturação térmica de ThCBHI em pH 5,0 também foi caracterizado por SAXS numa variação de temperatura de 20 a 70 ºC, com dados coletados a cada 5 ºC.

3.22 Predição dos sítios de glicosilação

Para predição dos sítios de glicosilação foi utilizado o programa CBS Prediction Servers para Glicosilação n-ligada – NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) e Glicosilação o-ligada –NetOGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/).

3.2 Cristalização, coleta de dados e processamento

Visto que, o número de variáveis que afetam a cristalização, tais como, concentração, temperatura, pH, força iônica, aditivos específicos e precipitantes, é grande e combinatória, o

domínio catalítico purificado de ThCBHI com 46 kDa (aminoácidos 18-449), na concentração de 8 mg/mL foi submetido a uma busca de condições de cristalização utilizando a técnica de

difusão de vapor em gota suspensa (hanging-drop). Gotas de 2 L de volume final (relação

1:1 de proteína e de solução precipitante) foram feitas automaticamente com o robô de cristalização Honeybee 931 (Genomic Solutions Inc), usando uma variedade de soluções precipitantes disponíveis comercialmente (nesta etapa foram testadas 650 condições diferentes) e as placas foram mantidas à temperatura de 18 ºC. Pequenos cristais em forma de agulhas, que foram posteriormente utilizadas como cristais-sementes, cresceram na solução contendo 35% de Polietilenoglicol (PEG) 4000 como precipitante. Técnicas como cristalização em gota imersa em óleo e seeding foram utilizadas para otimização e obtenção de cristais tridimensionais. Para a técnica de cristalização em óleo foram utilizadas placas de 72 poços (72-well MicroBatch plates, Hampton) com uma mistura 1:1 de óleo silicone e parafina para permitir a difusão da água pelo óleo e consequentemente aumentar a concentração da gota de cristalização. Streakseeding, método que permite a introdução de cristais-sementes em uma gota de cristalização, foi implementado tanto em gotas suspensas como em gotas sentadas em placas de 24 poços (24-well Linbro plates). Esses cristais- sementes, obtidos anteriormente, foram inseridos na gota pré-preparada utilizando-se um pelo de cavalo.

Um aglomerado de cristais do CCD de ThCBHI na forma de agulhas foi manipulado com uma agulha de acupuntura para separação dos mesmos e uma única agulha cristalina foi transferida para uma solução crioprotetora contendo uma mistura de 35% de PEG 4000 e 20% de PEG 400. O cristal foi então montado em um loop e congelado diretamente no fluxo de vapor nitrogênio, antes da análise dos dados de raios-X. O conjunto de dado de difração do cristal foi coletado na linha MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron LNLS (Campinas, Brasil), utilizando-se um detector marCCD 100 _{e comprimento de onda ( ) de 1,46}

nm. O cristal apresentou alto poder de difração com resolução máxima de 1,7Å. Esse conjunto de dados foi coletado aplicando-se o método de oscilação com cobertura de um total de 180º do cristal. A indexação, integração e o escalonamento dos dados foram realizados com o

programa HKL2000. 101 A estrutura cristalográfica do CCD de ThCBHI foi determinada pelo

método de substituição molecular com o programa Phaser 102 utilizando-se as coordenadas atômicas da estrutura cristalográfica do CCD de TrCBHI (código PDB 8CEL) como modelo. O mapa 2Fo – Fc calculado da solução única resultante das funções de rotação e translação,

aplicadas para a obtenção de fases do modelo, revelou uma densidade eletrônica contínua para a proteína e também foi possível observar densidades eletrônicas no interior do sítio catalítico

para moléculas que não foram incluídas originalmente no modelo de busca. Modelagem e refinamento da estrutura foram realizadas com o programa Coot 103 e Refmac 102. Um ciclo de refinamento “simulated-annealing” também foi realizado com o programa Phenix 104_.

Moléculas de água foram adicionadas ao modelo com o programa Arp/wArp 105_{, e a qualidade}

estereoquímica do modelo final foram validadas com o programa MolProbity 106.

As simulações de dinâmica molecular foram realizadas pelo grupo do Prof. Dr. Munir Skaf do Instituto de Química da Unicamp. As coordenadas iniciais para simulações de MD do CCD de T. harzianum e T. reesei foram tomadas a partir da estrutura cristalográfica obtida e do Protein Data Bank (PDB ID 8CEL).

3.24 Microscopia Eletrônica de Varredura

A microscopia eletrônica de varredura (MEV ou SEM) é uma técnica bem estabelecida para a obtenção de imagens superficiais de sólidos orgânicos e inorgânicos utilizada em diversas áreas, sobretudo em biologia, geologia e ciência dos materiais. As imagens obtidas são formadas a partir da interação de um feixe de elétrons focalizado sobre a amostra que varre a sua superfície ponto a ponto.A morfologia do papel filtro, antes e depois de ser submetido ao ataque da enzima ThCBHI, foi analisada utilizando um microscópio eletrônico de varredura, equipado com canhão de emissão de campo (FEI Quanta 650). Este experimento foi realizado no LNNano (Laboratório Nacional de Nanotecnologia), Campinas, SP. A hidrólise ocorreu durante 24h a 50 ºC, colocando-se um disco de 0,7 cm de papel de filtro Wathman nº 1 em cada tubo de eppendorf.com 1mg/mL de ThCBHI em tampão citrato (pH 5,0).

As diferentes amostras de papel hidrolisado foram secas em estufa a 60 ºC e fixadas em suportes de amostras de MEV, usando um pequeno pedaço de fita de carbono. Em seguida, foram revestidas com ouro em um metalizador SCD Balzers 050 por pulverização catódica (corrente 40 mA, tempo de 60 s). Um grande número de imagens foi obtido em diferentes áreas das amostras para garantir a reprodutibilidade dos resultados.