Espectroscopia de fluorescência com resolução temporal

Considere a excitação de um fluoróforo com um pulso de luz infinitamente curto, resultando em uma população inicial (N0) de fluoróforos no estado excitado. A relaxação do estado excitado S10 será governada por um decaimento que leva em consideração todos os processos descritos previamente na seção anterior e nos permite escrever a taxa de decaimento do estado singleto como a soma de todos estes processos:

) fluorescência, conversão interna e por cruzamento intersistêmico, do estado S₁ para o estado T₁.

Considerando que a soma de todas estas taxas é a taxa do decaimento do estado S10, podemos reescrever esta equação como:

fluorescência, é obtida a intensidade de fluorescência e não o número de partículas excitadas, a intensidade de fluorescência I(t), que é proporcional à população no estado excitado [I(t) = g N(t)], pode ser escrita como:

 /

) 0

(t I e ^t

I  ^ (25)

em que I0 corresponde à intensidade no instante diretamente depois da excitação da amostra t

= 0. Para decaimentos de intensidade que apresentam mais de uma componente, os ajustes são feitos por multi-exponenciais:

em que A_i representam as amplitudes das componentes para t = 0 (chamadas de fatores pré-exponenciais e representam a fração de moléculas em cada uma das conformações em t = 0), τi são os tempos de decaimento e n é a quantidade de tempos de decaimento.

O tempo

S1

 pode ser medido, por exemplo, através do decaimento da intensidade de fluorescência da amostra em função do tempo e, portanto, é comum chamar

S1

 de tempo de vida da fluorescência (τfl). O tempo de vida de fluorescência de uma substância geralmente representa um valor médio do tempo que a molécula permanece no estado excitado antes de retornar para o estado fundamental. A emissão de fluorescência é um processo aleatório e poucas moléculas emitem seus fótons precisamente em t = τfl.

O tempo de vida de fluorescência pode ser medido através de técnicas resolvidas no tempo.

Medidas do tempo de vida podem revelar a taxa de transferência de energia e a taxa de reações no estado excitado, assim como revelar detalhes sobre as interações das moléculas com sua vizinhança. Como os tempos de vida de fluorescência se encontram na faixa de nanossegundos torna-se necessário o uso de dispositivos de alta velocidade e detectores adequados. Existem três métodos amplamente usados para medir tempos de vida: o método de pulsos, o método estroboscópico e o método harmônico ou de modulação de fases.

Neste trabalho, os experimentos de fluorescência com resolução temporal foram realizados empregando um sistema baseado no método de correlação temporal de fótons únicos (Time-correlated single photon counting - TCSPC). Neste método, a amostra é excitada com um pulso de luz extremamente curto e é medido o intervalo de tempo transcorrido entre a absorção do pulso e a emissão de um fóton por fluorescência da amostra.

O tempo é medido entre o pulso de excitação e o fóton observado, sendo armazenado num histograma. O eixo x representa o intervalo de tempo e o eixo y, o número de fótons detectados neste intervalo de tempo (figura 25). Para o TCSPC as condições são ajustadas de modo que, tipicamente, a taxa de detecção é de um fóton por 100 pulsos de excitação do laser.

O experimento começa com o pulso de excitação que excita as amostras. Cada pulso é opticamente monitorado por uma fotomultiplicadora para produzir um sinal inicial que passa através de um discriminador de fração constante (do inglês Constant Fraction Discriminator, CFD) que mede com precisão o tempo de chegada do pulso. Este sinal é passado para um conversor de tempo-amplitude (Time-to-Amplitude Converter (TAC)) que gera uma rampa de tensão. Um segundo canal detecta o pulso do único fóton detectado. O tempo de chegada do sinal é determinado com exatidão utilizando o CFD, que envia um sinal para parar a rampa de tensão. O TAC contém agora uma voltagem proporcional ao tempo de atraso (Δt) entre os sinais de excitação e de emissão. Um analisador multicanal (multi-channel analyser, MCA) converte esse valor de tensão em um canal de tempo usando um conversor analógico-digital (analog-to-digital converter, ADC). Repetindo este processo várias vezes, um histograma de contagens versus canais de tempo é construído. O experimento transcorre até atingir um pico de 10000 contagens no canal do pico. Sob essas condições, o histograma dos tempos de chegada dos fótons representa o decaimento da intensidade da amostra.

Figura 25. Figura ilustrativa que mostra o princípio da TCSPC. Adaptado de (83).

As medidas de fluorescência com resolução temporal foram realizadas em um equipamento de microscopia de fluorescência com resolução temporal MicroTime 200 (PicoQuant), do Laboratório de Fotobiofísica da FFCLRP – USP.

Os experimentos foram realizados utilizando uma objetiva Olympus UPlanSApo de imersão em água com aumento de 60 vezes e abertura numérica de 1,2. Um volume de cerca de 50 μL da solução é colocado sobre uma lamínula de vidro, sendo as medidas feitas 20 μm acima da superfície da lamínula. Para os corantes, as amostras foram excitadas com um laser de 640 nm, com frequência de 40 MHz e potência de excitação de até 50 μW na objetiva. O dicroico utilizado foi o z638rdc e a posição do tubo de lentes foi fixada em 27,0 mm, focando o feixe de emissão no pinhole de 50 μm. Para a emissão, foi utilizado um filtro passa banda HQ690/70M. Para os fotoprodutos, o laser de excitação utilizado foi de 530 nm, com frequência de 40 MHz e potência de excitação de até 50 μW na objetiva. O dicroico utilizado foi o z532rdc e a posição do tubo de lentes foi fixada em 28,0 mm, focando o feixe de emissão no pinhole de 50 μm. Para a emissão, foi utilizado um filtro passa alta HQ550LP. A detecção foi feita por um detector MPD SPAD com área sensível de 50 μm². Antes de iniciar as medidas, o sistema é realinhado para maximizar a coleta do feixe de emissão através do seu alinhamento no pinhole e na área do detector.