O NIRS, do inglês Near InfraRed Spectroscopy (Espectroscopia de Infravermelho Próximo), é uma técnica rápida e não destrutiva de análise espectroscópica que fornece informações físicas e químicas de qualquer matéria. Normalmente sua utilização é feita em conjunto com uma análise multivariada dos dados obtidos, gerando novas perspectivas para análises quantitativas e qualitativas (REICH, 2005).
As técnicas espectroscópicas são baseadas nas interações da radiação eletromagnética com a matéria, pois a partir da análise dos espectros formados, é possível obter informações a respeito da constituição, estrutura e interação molecular (ASSIS, 2018). O espectro eletromagnético é subdividido em sete regiões, sendo elas: ondas de rádio, micro-ondas, infravermelho, luz visível, ultravioleta, raios x e raios gama, definidas a partir de determinados intervalos de comprimento de onda (Figura 14).
Figura 14 - Espectro Eletromagnético
Fonte: adaptado e disponível em (br.freepik.com)
Metodologias que utilizam técnicas espectroscópicas baseadas no infravermelho tem ganhado espaço na comunidade científica como alternativa para o screening de analitos presentes em amostras biológicas por explorar as vibrações das ligações químicas presentes nas moléculas (PARASKEVAIDI et al., 2018). A região do espectro denominada de infravermelho compreende a faixa de radiação com números de onda no intervalo entre 12800 a 400 cm-1 e é normalmente dividida em infravermelho próximo (NIR), infravermelho médio (MIR) e infravermelho distante (FIR) (ASSIS, 2018) (Figura 15).
Figura 15 - Regiões do Infravermelho
Fonte: adaptado de (REICH, 2016)
O NIR está uma região do espectro que tem o comprimento de onda no intervalo entre 700 e 2500 nm, entretanto, o NIR-visível (650 – 1100 nm) é conhecido como a janela óptica mais adequada para a análise de amostras biológicas (SAKUDO et al., 2012). Isto por que a absorção molecular nessa região costuma ser causada
pelas vibrações das ligações químicas entre os grupos CH, OH e NH, os quais estão presentes em abundância nas amostras biológicas, como sangue, plasma, urina, pele, material genético, entre outras (SAKUDO, 2016).
O NIR possui simples execução bem como pouco ou nenhum preparo da amostra a ser analisada. As técnicas de captura do espectro de absorção podem ser obtidas por transmitância, reflectância e transflectância (BAKER et al., 2014; MARTENS; STARK, 1991), onde cada uma é adequada para um tipo específico de amostra. Normalmente utilizam-se sondas para direcionar o feixe de IR para a amostra a ser testada. A aquisição dos espectros é feita através de um espectrômetro, o qual envia os espectros gerados para um computador que fará a análise multivariada com o auxílio de algoritmos quimiométricos de classificação.
Esse método já foi utilizado para promissoras aplicações na área da saúde, como a classificação de grupos de Aedes aegypti infectados por zika vírus de mosquitos não infectados (FERNANDES et al., 2018), diferenciar cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras e não produtoras de carbapenemase 2 (MARQUES et al., 2015), estudos da pele (MANSFIELD et al., 2005), diabetes (PICHLER et al., 2009), doença de Alzheimer (PARASKEVAIDI et al., 2018), entre outras. Sua utilização também já foi testada com o HIV, entretanto, com outros objetivos que não a discriminação de grupos infectados e saudáveis (SAKUDO et al., 2008, 2012).
Dessa forma, acredita-se que a técnica possui grande potencial para aplicações diagnósticas, como no caso do HIV, que apesar de possuir métodos de diagnóstico bem estabelecidos e aceitos na comunidade científica, ainda apresenta limitações de complexidade e custo que poderiam ser auxiliadas com a utilização de uma técnica como o NIR, de fácil execução, rápida, possivelmente portátil, e que pode servir como um screening de pacientes, diminuindo assim o número de testes mais complexos a serem realizados.
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3 NORMAS DO PERIÓDICO/REVISTA
A revista escolhida para a submissão do artigo foi a “Diagnostic Microbiology and Infectious Disease” da Elsevier. A revista possui fator de impacto igual a 2.499 e o CiteScore de 4.5. Seu escopo abrange a microbiologia clínica, bem como diagnósticos e tratamentos para doenças infecciosas. Seus artigos normalmente se encaixam nos seguintes tópicos: comentários informativos sobre novos antibióticos; métodos laboratoriais rápidos e custo-efetivos; estudos de casos com ênfase em circunstancias complexas; editoriais perspicazes em causas importantes; revisões de literatura.
O site da revista fornece um documento guia em pdf para os autores bastante extenso e pouco objetivo. Seguem as normas sumarizadas retiradas do guia para autores:
Número máximo de palavras do manuscrito: 3500;
Número máximo de palavras para abstract: 150;
Número máximo de tabelas e/ou figuras: 5;
Incluir figuras e tabelas ao longo do manuscrito com suas respectivas legendas;
Incluir autor correspondente e email de todos os autores;
Incluir palavras-chave (máximo 6);
Referências podem estar organizadas em qualquer estilo, contanto que seja um estilo consistente;
Incluir declaração de conflito de interesses;
Incluir parecer do comitê de ética (Declaração de Helsinki);
Uso de linguagem inclusiva;
Incluir as contribuições dos autores;
Numerar as diferentes seções do artigo;
Não há restrição de formatação;
Incluir o financiamento do trabalho;
Fórmulas matemáticas devem ser inseridas no formato de texto editável;
4 ARTIGO
Título: Espectroscopia no infravermelho próximo em plasma sanguíneo com análise quimiométrica para classificação de HIV em gestação.
Autores: Ana F. S. Peres1,2, Lidiane G. Silva3, João V. M. Mariz3, Daniel L. D. Freitas3,
Marcos G. Santos1,4, Rayanne S. P. Morais1, Camilo L. M. Morais5, Francis L. Martin6,
Daniel A. V. Pascoal2, Juliana D. de A. S. Camargo2, Kassio M. G. Lima3, Janaina C.
O. Crispim1,2
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal 59072-970, Brazil
2Maternidade Escolal Januário Cicco, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal 59072-970, Brazil
3Química Biológica e Quimiometria, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal 5072-970, Brazil
4Instituto do Cérebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal 59056-450, Brazil
5Escola de Farmácia e Ciências Biomédicas, University of Central Lancashire, Preston PR1 2HE, UK
6Biocel Ltd, Hull HU10 7TS, UK
Autor Correspondente:
Janaína Cristiana de Oliveira Crispim
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Maternidade Escola Januario Cicco Avenida Nilo Peçanha, 259 – Petrópolis, Natal – RN
Zip code: 59012-310
Phone/FAX: +5584 999867758 Email: [email protected]
Ana Peres: [email protected]; Lidiane Silva: [email protected]; Joao Mariz:
[email protected]; Daniel Freitas: [email protected]; Marcos Santos: [email protected]; Rayanne Morais: [email protected]; Camilo Morais: [email protected]; Francis Martin:
[email protected]; Daniel Pascoal: [email protected]; Juliana Camargo:
[email protected]; Kassio Lima: [email protected]; Janaina Crispim: [email protected].
Contribuições dos autores:
A.F.S.P., M.G.S. e R.S.P.M. foram responsáveis pela coleta das amostras. A.F.S.P.
foi responsável pela aquisição dos espectros. A.F.S.P., L.G.S. e J.V.M.M. foram responsáveis pela escrita do primeiro rascunho do manuscrito. J.D.A.S.C. foi responsável pela análise estatística dos dados clínicos. D.A.V.P. foi responsável pelo suporte médico e clínico das pacientes. D.L.D.F. foi responsável pela construção dos modelos quimiométricos e análise multivariada. C.L.M.M. e F.L.M. deram suporte quimiométrico e finalizaram o manuscrito. K.M.G.L. e J.C.O.C. planejaram os experimentos, supervisionaram o projeto e revisaram o manuscrito.
Todos os autores aprovaram o artigo final.
Conflito de interesses:
F.L.M. foi recentemente contratado pela Biocel Ltd, uma companhia que desenvolve técnicas analíticas similares à usada no artigo para lucro comercial.
Padrão de ética:
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsinki. CAAE: 41768314.8.0000.5292.
Suporte financeiro:
Espectroscopia no infravermelho próximo em plasma sanguíneo com análise quimiométrica para classificação de HIV em gestação
RESUMO
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode ser transmitido de diversas maneiras, e uma delas é da mãe para o filho durante a gestação, conhecida como transmissão vertical (TV). O diagnóstico laboratorial durante o pré-natal é a única forma de prevenir a transmissão vertical, uma vez que tratamentos baseados em drogas antirretrovirais durante a gestação e primeiras semanas após o parto estão amplamente disponível nos serviços de saúde pública. Com isso, a espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) foi usada para analisar amostras de plasma sanguíneo de gestantes para detecção da infecção por HIV. Setenta e sete amostras (39 pacientes infectadas com HIV e 38 pacientes saudáveis como controle) foram analisadas. A análise quimiométrica de classificação do espectro resultante do NIR facilitou a segregação diagnóstica de ambas categorias de amostras de modo rápido e não destrutivo, gerando uma acurácia de 87%, sensibilidade de 83% e especificidade de 91%. Esse método é simples e de baixo custo, e pode facilmente ser adaptado como método de triagem portátil, o que vem a ser essencial para monitorar riscos de TV em locais de difícil acesso ou nos países em desenvolvimento.
Palavras-chave: HIV, infravermelho próximo, quimiometria, gestação
1 INTRODUÇÃO
A transmissão de mãe para filho do vírus da imunodeficiência humana (HIV) durante a gestação, parto e/ou amamentação é denominada transmissão vertical (TV). Mundialmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou cerca de 1.3 milhões de mulheres grávidas infectadas pelo HIV 1, enquanto que no Brasil, 125.144 casos
foram diagnosticados entre 2000 e 2019, segundo o boletim epidemiológico do Ministério da Saúde 2. Entre todas as gestantes infectadas pelo HIV, 15 a 45% delas
irá transmitir o vírus para seus bebês caso diagnóstico e tratamento adequados não sejam realizados 3. Essa forma de contágio possui grande relevância e atenção por
parte dos órgãos de saúde devido às consequências negativas que ela pode trazer para a mãe e seu filho, como aborto, natimortalidade, morte neonatal, nascimento prematuro, baixo peso de nascimento, entre outros 4.
O diagnóstico precoce e tratamento com antirretrovirais são medidas com alto potencial de reduzir o risco da TV, para até menos de 5% 3. Dessa forma, os órgãos
de saúde pública têm influenciado cada vez mais a detecção desses casos, aumentando cerca de 21% os diagnósticos no pré-natal nos últimos 10 anos 5.
Entretanto, estudos relacionados à qualidade do pré-natal no Brasil mostram que aproximadamente só 15% das gestantes cumprem o cronograma de consultas e exames necessários e receberam uma atenção de qualidade. Entre os exames complementares como a testagem para HIV, notou-se que apenas pacientes com mais idade, melhor escolaridade e condições financeiras completam todas as solicitações médicas; portanto, muitas pacientes chegam ao parto sem o diagnóstico para HIV, e consequentemente, sem tratamento 6.
O HIV pode ser identificado por alguns tipos de testes sanguíneos, como os imunoensaios de triagem [imunocromatografia (teste rápido), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)], os quais detectam anticorpos ou antígenos virais. Outras metodologias consideradas complementares e/ou confirmatórias como Western Blot, ImunoBlot ou Teste de Amplificação de Ácidos Nucléicos (NAATs) também pode ser empregadas 7. Apesar de tais testes serem bem aceitos na
comunidade científica pelos seus níveis de sensibilidade e especificidade 8, eles
geralmente possuem custo alto e requerem mão de obra qualificada para seu desenvolvimento e aplicação.
Novas metodologias baseadas em técnicas espectroscópicas são uma alternativa para a triagem metabólica de biofluidos. Espectroscopia de massa e ressonância nuclear magnética são as técnicas mais comuns devido sua relativa boa sensibilidade e especificidade de detectar doenças, contudo elas possuem um elevado custo e necessitam de configuração experimental complexa 9. A
espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) é uma técnica que explora as movimentações vibracionais das ligações químicas das moléculas presentes em uma amostra, excitando-as em uma região do espectro eletromagnético correspondente a um comprimento de onda que varia entre aproximadamente 750 a 250010-12. É uma
técnica relativamente simples e de baixo custo quando comparada à espectroscopia de massa, ressonância nuclear magnética ou até espectroscopia de infravermelho médio, e disponível na forma de dispositivos portáteis para análises em campo. Além da simples instrumentação, ela ainda é não destrutiva e livre de reagentes, e as medidas experimentais pode ser realizadas de forma rápida e com nenhuma ou mínima preparação da amostra.
Como exemplo de aplicações clínicas, o NIR foi usado para detecção da doença de Alzheimer em plasma sanguíneo com 93% de acurácia, 88% de sensibilidade e 96% de especificidade 12; para diferenciar colônias de Klebsiella
pneumonia produtoras e não produtoras de carbapenamase 13; e para a identificação
de mosquitos Aedes aegypti infectados ou não pelo Zika vírus 14. Sua utilização
também já foi testada com o HIV, entretanto, com outros objetivos que não a discriminação de grupos infectados e saudáveis10.
A maioria das moléculas orgânicas apresentam padrões de absorbância no NIR. A interação entre a radiação e a amostra gera um espectro característico e individual que indica a composição da amostra, e este pode ser usado para obtenção de informações quantitativas e qualitativas. As bandas mais proeminentes no NIR incluem sobretons e combinações de vibrações fundamentais dos grupos –CH, -NH, -OH 11,15–18; consequentemente, todas a moléculas biologicamente relevantes como proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos nucleicos contribuem para o sinal do NIR. O dispositivo do NIR pode ser ajustado para os modos de transmissão, reflexão ou transflectância 19,20, os quais se adequam para tipos específicos de amostras. Para
amostras líquidas, os modos de transmissão ou transflectância são mais comuns, e o último foi usado no presente trabalho. No modo de transflectância, o feixe do infravermelho atravessa a amostra e reflete de volta no leitor, consequentemente, a luz atravessa a amostra duas vezes. As medidas são realizadas através do uso de sondas de fibra óptica 19. Vantajosamente, a aquisição dos espectros pode ser feita
Aqui, o NIR foi utilizado para diferenciar gestantes infectadas com HIV de gestantes saudáveis do grupo controle (sem comorbidades). Para isso, diferentes